3. ACTIVIDAD ENZIMÁTICA PARTE II. FACTORES QUE MODIFICAN LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS: EFECTO DE LA CONCETRACIÓN DE SUSTRATO Y DE UN INHIBIDOR.

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1 3. ACTIVIDAD ENZIMÁTICA PARTE II. FACTORES QUE MODIFICAN LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS: EFECTO DE LA CONCETRACIÓN DE SUSTRATO Y DE UN INHIBIDOR

2 ¿Qué son las enzimas? Son proteínas que catalizan reacciones bioquímicas que se llevan a cabo en la célula (catalizadores biológicos). Tienen un sitio activo donde se encuentran los grupos químicos responsables de la reacción. Son altamente específicas a la reacción que catalizan (catalizadores específicos), que catalizan un solo tipo de reacción y casi siempre actúan sobre un solo sustrato o un grupo reducido de ellos. Muchas de las enzimas necesitan de cofactores para realizar su función. Su función depende de la integridad de la proteína. Dependen en su mayoría de grupos metálicos unidos al grupo activo o como cofactores. Los reactivos de las reacciones catalizadas por las enzimas se denominan sustratos.

3 La velocidad de una reacción catalizada por una enzima depende de varios factores:
Actividad enzimática La concentración del sustrato [S]. Concentración de la enzima La temperatura. El pH del medio, afectando la conformación de la enzima. La presencia de inhibidores. Los Activadores

4 Regulación de la actividad enzimática
Modificaciones en la enzima Unión de ligandos (sustratos y no sustratos) Inhibidores Activadores Regulación covalente Fosforilación Proteólisis Isoenzimas Cantidad de enzima Síntesis Expresión del gen Síntesis en el ribosoma Degradación

5 Regulación de la actividad enzimática por unión a ligandos que no son sustratos
Inhibidor: Sustancia que puede impedir que la enzima desarrollo su actividad catalítica. Puede disminuir la velocidad de la reacción. Activador: Sustancia que al unirse a la enzima puede activar el desarrollo de la actividad catalítica y aumentar la velocidad de la reacción.

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7 Ecuación de Michaelis - Menten

8 Parámetros enzimáticos
Vmax: Se alcanza cuando todos los sitios activos están ocupados por el sustrato (100% de los sitios activos). Cuando toda la enzima esta como [ES]. KM: Concentración de sustrato a la que V0 es la ½ de Vmax (50% de los sitios activos ocupados). Cuanto menor es la Km, mayor es la afinidad de la enzima por el sustrato. Es constante en cada enzima. (Constate de Michaelis-Menten) KCAT: Número de recambio. Número de moléculas de sustrato convertidos en producto por unidad de enzima y unidad de tiempo en condiciones saturantes del sustrato. Constante de especificidad (Vmax/Km o Kcat/Km): Indica cual es el mejor sustrato (aquel que tenga la mayor constante). Indica a eficiencia catalítica de la enzima. Representa el paso de unión de la enzima y el sustrato (cualquier factor que afecte esta afectando la constante de paso de unión).

9 La enzima más eficiente es aquella que posee el mayor valor de KCAT/Km (Constante de especificidad).

10 Unidades de los parámetros enzimáticos

11 Transformación de la ecuación de Michaelis-Menten
Lineal 1/v vs 1/[S] (Dobles recíprocos o Linewever-Burk) Sigmoidal v vs log S (Semi-logarítmica)

12 Representación Linewever-Burk o Dobles recíprocos
Forma lineal de la ecuación de Michaelis – Menten. Los valores de Vmax y Km pueden calcularse gráficamente si se representan 1/v frente a los valores 1/[S].

13 Gráfica de representación de Eadie-Hofsteen
Ecuación de Eadie-Hofsteen de la velocidad de la reacción La representación de Vo frente a Vo/[S] se conoce como la representación de Eadie-Hofsteen. Donde: Vo = representa la velocidad de la reacción Km = constante de Michaelis- Menten [S] = concentración de sustrato Vmax = máxicmo de la velocidad de la reacción Se le asigna el mismo peso a todos lo puntos para cualquier rango de concentración del sustrato, tiene menos margen de error. Las variables son dependientes de la velocidad de la reacción. Se obtiene multiplicando ambos miembros de la ecuación Lineweaver-Burk por Vmax.

14 Inhibición de la actividad enzimática
Inhibidores presentes en la célula: regulación metabólica. Agentes tóxicos o drogas: acción tóxica. Agentes farmacológicos: acción terapéutica. Tipos de inhibición: Irreversible Reversible Competitivo No competitivo Incompetitivo

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16 Tipos de inhibidores Reversibles
Competitiva: El inhibidor se une a la enzima libre interfiriendo con la unión del sustrato. Incompetitivo: El inhibidor se une al complejo enzima-sustrato interfiriendo con la formación de producto. Mixto: El inhibidor se une tanto a la enzima libre como al complejo enzima sustrato, interfiriendo la unión del sustrato y la formación del producto. No competitivo: Es un tipo especial de inhibidor mixto que se une con igual afinidad a la enzima libre y al complejo enzima-sustrato.

17 Inhibición competitiva
El inhibidor competitivo se une a la enzima libre. Compite con el sustrato por el sitio de unión en la enzima. (Se une al sitio catalítico). Analogía estructural con el sustrato. Aumenta la Km sin afectar Vmax. La unión se revierte con la adición de más sustrato. Reduce la concentración de enzima libre disponible.

18 Patrones de inhibición competitiva
Km es mayor, Vmax no cambia Tomando los inversos tenemos: La ecuación corresponde a una línea recta: Y = mX + b. En donde: Y = 1/v y X = 1/[S]. La pendiente m = KM/Vmax; y la intercepción en el eje Y, b = 1/Vmax.

19 Inhibición competitiva
Km es mayor Ecuación de velocidad en presencia de un inhibidor competitivo.

20 Tipos de inhibidores Reversibles
Competitiva: El inhibidor se une a la enzima libre interfiriendo con la unión del sustrato. Incompetitivo: El inhibidor se une al complejo enzima-sustrato interfiriendo con la formación de producto. Mixto: El inhibidor se une tanto a la enzima libre como al complejo enzima sustrato, interfiriendo la unión del sustrato y la formación del producto. No competitivo: Es un tipo especial de inhibidor mixto que se une con igual afinidad a la enzima libre y al complejo enzima-sustrato.

21 Inhibición incompetitiva
El inhibidor competitivo se une al complejo enzima-sustrato (ES) . Interfiere con la formación de producto. El inhibidor se une a un sitio diferente al sitio catalítico donde se une el sustrato. Disminuye la Km y la Vmax, pero no altera el cociente Km/Vmax . Produce una distorción estructural del sitio activo, inactivando la enzima.

22 Patrones de inhibición incompetitiva
Disminuye Km y Vmax

23 Inhibición incompetitiva
Disminuye Km y Vmax Ecuación de velocidad en presencia de un inhibidor incompetitivo.

24 Tipos de inhibidores Reversibles
Competitiva: El inhibidor se une a la enzima libre interfiriendo con la unión del sustrato. Incompetitivo: El inhibidor se une al complejo enzima-sustrato interfiriendo con la formación de producto. Mixto: El inhibidor se une tanto a la enzima libre como al complejo enzima sustrato, interfiriendo la unión del sustrato y la formación del producto. No competitivo: Es un tipo especial de inhibidor mixto que se une con igual afinidad a la enzima libre y al complejo enzima-sustrato.

25 Inhibición mixta El inhibidor mixto puede unirse a la enzima libre o al complejo ES. Interfiere en la unión del sustrato y la formación del producto. Aumenta la Km y disminuye la Vmax.

26 Patrones de inhibición no competitiva
Aumenta la Km y disminuye la Vmax.

27 Inhibición no competitiva
Es un tipo especial de inhibidor mixto que se une con igual afinidad a la enzima libre o al complejo ES. El inhibidor se une a un sitio diferente al sitio catalítico donde se une el sustrato. Disminuye la Vmax, pero Km no se altera.

28 Patrones de inhibición no competitiva
Disminuye Vmax, Km no se altera

29 Inhibición no competitiva
Disminuye Vmax, Km no se altera Ecuación de velocidad en presencia de un inhibidor no competitivo.

30 Patrones linearizados de las curvas con inhibidor y sin inhibidor para identificar el tipo de inhibición

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32 Práctica Determinar la cantidad de sustrato en la cual la enzima alcanza su Vmax. Calcular los parámetros cinéticos de la reacción catalizada de la enzima LDH utilizando diferentes gráficos de la ecuación linearizada de Michaelis-Menten. Determinar el efecto de un inhibidor (Oxamato) en la actividad de LDH. Analizar el efeto del inhibidor sobre los parámetros cinéticos.

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