TEMA: Factores de eficacia de los Enzimas

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1 TEMA: Factores de eficacia de los Enzimas
Factores del centro activo que contribuyen a la eficacia de los enzimas: Factores de proximidad, orientación y distorsión Factor de microambiente Factores de catálisis ácido-base y catálisis covalente Medida y Expresión de la actividad enzimática: Velocidad de reacción y eficacia enzimática Unidades de actividad enzimática Ecuación de Michaelis-Menten: importancia práctica Linealización de la ecuación de Michaelis-Menten: Lineweaver-Burk Eadie-Hofstee

2 Factores de la eficacia de un enzima
Distorsión Tensión de enlaces Rotación de enlaces Microambiente Concentración de grupos reactivos Potenciación de la reactividad Orientación Entre sustratos Con respecto al sitio catalítico Catálisis ácido-base Específica (H+/OH-) General (resíduos) Proximidad Entre sustratos Al sitio catalítico Catálisis covalente Ataque nucleofílico Ataque electrofílico

3 Grupos ionizables en el centro activo

4 Catálisis ácido-base: Ataque ácido

5 Catálisis ácido-base: Ataque básico

6 Catálisis covalente Algún grupo químico del enzima ataca al sustrato, formando un intermediario covalente Los ataques son nucleofílicos o electrofílicos Es una forma transitoria y muy reactiva que genera rápidamente el producto y libera al enzima AMINOACIDOS IMPLICADOS Ser, Thr, Asp, Cys, Lis, His TIPOS DE INTERMEDIARIOS: Fosfoenzima Acil enzima Base de Schiff

7 ENZIMA ACTIVO REGENERADO
Catálisis covalente ATAQUE NUCLEOFILICO INTERMEDIO COVALENTE (ACIL ENZIMA) ENZIMA ACTIVO REGENERADO

8 Estudio de la velocidad de una reacción enzimática
CINETICA: Estudio de la velocidad de cambio de sustratos a productos VELOCIDAD: Cambio en la concentración de sustrato o producto por unidad de tiempo TASA: Cambio en la cantidad de sustrato o producto por unidad de tiempo V=-d[S]/dt = d[P]/dT Complejo Enzima-Sustrato Sustrato Producto

9 Curva de progreso de una reacción enzimática
S4>S3>S2>S1 Orden 0 Orden 1

10 Medida de la velocidad de una reacción enzimática
V=-d[S]/dt = d[P]/dT Midiendo la desaparición del sustrato o la aparición del producto En presencia de cantidades catalíticas de enzima (típicamente: M) Se determina la velocidad inicial de reacción ([S] es prácticamente constante)

11 Expresión de la velocidad de una reacción enzimática
ACTIVIDAD CATALITICA: Unidad Estándar de Actividad Enzimática (IU): Cantidad de enzima que cataliza la formación de 1 mmol de producto por minuto en condiciones determinadas (37ºC, [S] saturante) Katal: Cantidad de enzima que cataliza la formación de 1 Mol de producto por segundo en condiciones determinadas (37ºC, [S] saturante) CONCENTRACION: Unidades de actividad enzimática por unidad de volumen (U/mL) PUREZA: Actividad específica: Unidades de actividad enzimática por mg de proteína total

12 Ecuación de Michaelis-Menten: Enzimas con saturación por sustrato
Expresión matemática de la cinética enzimática k1 E +S ES E+P k3 k2 Ecuación de Michaelis-Menten: Enzimas con saturación por sustrato Vmax= k3 [ES] Km= k2+k3 k1 Vmax x [S] Km + [S] V= El complejo ES está en estado estacionario Todo el enzima está en forma ES La velocidad de formación de P es máxima

13 El modelo de Michaelis-Menten
V0 de [S4] Velocidad inicial (V0) Velocidad máxima (Vmax) Conc. de sustrato [S] E + S ES E+P k1 k2 k3 k4 Equilibrio

14 El modelo de Michaelis-Menten
Curva hiperbólica Cinética de saturación Cinética de Michaelis-Menten [S] = KM  V = Vmax/2 [S] >> KM  V = Vmax Vmax ·[S] Km + [S] V=

15 (Supuestos de aplicación)
El estado estacionario en la cinética enzimática Modelo del estado estacionario (Supuestos de aplicación) La concentración de ES es constante: V formación = V destrucción Cuando [S] es saturante, todo el enzima está en forma ES: [ET] ≈ [ES] Al inicio de la reacción, el paso ESE + P es irreversible

16 Implicaciones e interés práctico de la ecuación de Michaelis-Menten
Significado de Km (Constante de Michaelis-Menten): Concentración de sustrato para la que se alcanza la velocidad igual a la mitad de la máxima (Vmax) Indica la afinidad de un enzima por un sustrato determinado Permite comparar la afinidad de un enzima por distintos sustratos y la afinidad de varios enzimas por el mismo sustrato Se puede determinar con facilidad en el laboratorio La velocidad de reacción es muy sensible a cambios en [S] en la zona de Km Significado de Kcat ( K3, Número de recambio): Número de moles de sustrato transformado por unidad de tiempo Su inversa define el tiempo requerido por el enzima para transformar una molécula de sustrato

17 Linealización de la ecuación de Michaelis-Menten
Representación de Lineweaver-Burk (1/V frente a 1/[S] Representación de Eadie-Hoffstee (V/[S] frente a V)