BIOQUÍMICA Enzimología.

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1 BIOQUÍMICA Enzimología

2 Enzimología Generalidades. Clasificación.
Modo de acción de las enzimas. Cinética de las reacciones simples catalizadas por enzimas. Ecuación de Michaelis-Menten. Actividad enzimática. Unidades. Cuantificación de la actividad enzimática. Coenzimas. Factores que afectan la cinética enzimática. Inhibidores enzimáticos. Regulación de la catálisis enzimática.

3 Catalizadores biológicos
Las enzimas son: No hacen factibles las reacciones imposibles Catalizadores biológicos Sin consumirse en una reacción, aumentan notablemente su velocidad Aceleradores Prácticamente todas las reacciones químicas que tienen lugar en los seres vivos están catalizadas por enzimas. Posibilitan la vida

4 Glucosa Fructosa 1,6 bis-Pato. 1,3 bis-P-Glicerato PEP Piruvato
C6H12O6 + 6 O2 -> 6CO2 + 6 H2O ∆G°´ kJ/mol Fructosa 1,6 bis-Pato. - 2 ATP 1,3 bis-P-Glicerato + 2 NADH + H+ PEP + 2 ATP Piruvato + 2 ATP Acetil-CoA + 2 NADH + H+ CO2 + Agua + 1 ATP + 3 NADH + H+ + 1 FADH2

5 Las enzimas son proteínas altamente especializadas
Las enzimas son proteínas altamente especializadas. Función: catálisis (o regulación de la velocidad) de las reacciones químicas en los seres vivos. E + P E + S [ES]

6 Las enzimas son proteínas* que catalizan reacciones químicas
Muchas reacciones requerirían condiciones extremas de presión, temperatura o pH sin catalizador, pero ocurren en condiciones fisiológicas con enzimas. Ej. Glc ----> CO2 + H2O en un calorímetro = Ø Las enz. aceleran a 1010 a 1014 veces más rápido que las reacciones no cataliza­das. Ureasa en orina = 1014 (significa que una reacción que catalizada toma 1 segundo podría tomar 3 millones de años sin estar catalizada). * En su mayoría son proteínas, hay ARN con capacidad catalítica (ribozimas)

7 Estructura de una enzima
Las proteínas enzimáticas están formadas por una gran cantidad de aminoácidos (AA), que cumplen funciones diferenciadas: No esenciales, estructurales, de unión y catalíticas. Los AA no esenciales pueden ser reemplazados y, en algunos casos, eliminados sin pérdida significativa en la función o conformación de una enzima. Los AA estructurales = conforma­ción de la enzima, "forman su esqueleto". Los AA de unión = asociación entre la enzima y el sustrato. Los AA catalíticos = transformación del sustrato.

8 Aspectos generales de las enzimas
Las enzimas son catalizadores específicos: cada enzima cataliza un solo tipo de reacción y casi siempre actúa sobre un único sustrato o un grupo muy reducido de ellos. Sustrato: sustancia sobre la que actúa la enzima

9 Especificidad de función de las enzimas

10 Mecanismo de la reacción enzimática
En toda reacción química se produce la transformación de una sustancia inicial, denominada sustrato (S), en una sustancia final o producto (P), según la siguiente notación:

11 Formación de productos
Reacción catalizada por una enzima: centro activo región concreta de la enzima donde el sustrato se une Enzima y su sustrato Unión al centro activo Formación de productos E + S  ES  E + P Complejo enzima-sustrato

12 El centro activo comprende
un sitio de unión formado por los aminoácidos que están en contacto directo con el sustrato y un sitio catalítico, formado por los aminoácidos directamente implicados en el mecanismo de la reacción Centro activo: Es el sitio donde están los AA de unión al S y los AA que median el efecto catalítico de la enzima. (uniones intermoleculares de la enzima c/el S en una orientación tal que encajan correctamente, como las piezas en un rompecabezas).

13 El sustrato se une a la enzima luego se inicia la catálisis
Sitio de unión: es el que le da la especificidad a la enzima Sitio catalítico

14 Nomenclatura Hay varias formas de nombrar una enzima: nombres particulares nombre sistemático código de la comisión de enzimas (EC = Enzyme Comission) de la UIB

15 Nomenclatura: nombres particulares
Antiguamente, los enzimas recibían nombres particulares, asignados por su descubridor. Ejemplos: amilasa (hidrolisa el almidón) glucoquinasa Glc + ATP  Glc-6P + ADP Al ir aumentando el número de enzimas conocidas, se hizo necesaria una nomenclatura sistemática que informara sobre la acción específica de cada enzima y los sustratos sobre los que actuaba.

16 Nomenclatura: nombre sistemático
Consta actualmente de 3 partes: el sustrato preferente el tipo de reacción catalizada terminación "asa" ejemplo: la glucoquinasa ATP:glucosa fosfo transferasa Glc + ATP  Glc-6P + ADP

17 Comisión de Enzimas Nomenclatura: __.__.__.__.
El nombre es identificado por un código numérico: encabezado por las letras EC (enzyme commission) seguidas de cuatro números separados por puntos. el primer número indica a cual de las seis clases pertenece la enzima, el segundo se refiere a distintas subclases dentro de cada grupo, el tercero y el cuarto se refieren a los grupos químicos específicos que intervienen en la reacción y el nº de orden en la lista.

18 Clasificación y Nomenclatura: Comisión de Enzimas
Clases Óxido-reductasas Transferasas Hidrolasas Liasas Isomerasas Ligasas

19 Nomenclatura: Comisión de Enzimas
Glucoquinasa Ej.: la ATP:glucosa fosfotransferasa (glucoquinasa) Glc + ATP  Glc-6P + ADP EC 2: transferasa 7: fosfotransferasa 1: el aceptor es un grupo OH 2: es un OH de la D-glucosa el que acepta el grupo fosfato.

20 Creatin fosfo quinasa Dímero: M (músculo) – B (cerebro) separables por electoforesis (método de estudio) Cerebro = BB (CPK1 - rápida) Músculo esquelético= MM (CPK3 - lenta) Corazón = MB (CPK2 - intermedia) h. 6% de la CPK total = UI/L a 30ºC.

21 Clasificación de enzimas
CK o CPK = EC : Creatina kinasa Clases Subclases Subsubclases Orden Wiki

22 CPK o CK ATP + Creatina (Ác. Alfa-metil guanido-acético) ADP
Fosfocreatina CH3 HO3P-

23 Lactato deshidrogenasa ó LDH
Tetramérica c/2 subunidades distintas: H de corazón y M de músculo, que se combinan de 5 formas. LDH1 – HHHH – Miocardio y LDH2 – HHHM - Miocardio y GR LDH3 - HHMM – Cerebro y riñón LDH4 – HMMM – Hígado y Músc. Esquel. LDH5 – MMMM – Músculo Esquelético

24 Isoenzimas de Amilasa (AMI)
alfa-Amilasa ó α-amilasa, EC (1,4-α-D-glucan glucanohidrolasa; glicogenasa) metaloenzima (dependiente de Ca). Corta enlaces glicosídicos alfa-1,4 al azar o at random. En animales es la mayor enzima digestiva y su pH óptimo es En el Hº amilasa salivar y pancreática son alfa-amilasas. Esta forma es también hallada en plantas, hongos y bacterias (Bacillus). β-Amilasa (EC   ) (1,4-α-D-glucan maltohidrolasa; glicogenasa) es también sintetizada por bacterias, hongos y plantas. Cataliza la hidrólisis del segundo enlace α-1,4 glicosídico desde el extremo no reductor, separando 2 unidades de glucosa (maltosa). Presente en semillas y granos de cereales; en muchos microorganismos que degradan el almidón extracelular. Los tejidos animales no contienen β-amilasa, pero puede estar presente en microorganismos del TD. El pH óptimo es

25 γ-Amilasa (EC   ) ó Glucan 1,4-alfa-glucosidasa ó amiloglucosidasa ó Exo-1,4-α-glucosidasa ó glucoamilasa; α-glucosidasa lisosomal; 1,4-α-D-glucan glucohidrolasa. Rompe los enlaces α(1-6) glicosídicos, como también el último enlace α(1-4)glicosídico del extremo no reductor de amilosa y amilopectina, produciendo glucosa. Es más activa a pH 3.

26 MODO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS
La acción de los catalizadores consiste en disminuir la Energía de activación Las enzimas son catalizadores especialmente eficaces, ya que disminuyen la Ea aún más que los catalizadores inorgánicos. Por ej, la descomposición del agua oxigenada (H2O2) puede ocurrir sin catalizador Ea= 18 Kcal/mol con un catalizador inorgánico (platino) Ea= 12 Kcal/mol con una enzima específica (catalasa) Ea= 6 Kcal/mol Así, se puede calcular que el platino acelera la reacción veces, mientras que la catalasa la acelera veces.

27 MODO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS
Dos modelos sobre la forma en que el sustrato se une al centro activo del enzima: el modelo llave-cerradura el modelo del ajuste inducido

28 MODELO LLAVE-CERRADURA
La estructura del sustrato y la del centro activo son complementarias Este modelo es válido en muchos casos, pero no es siempre correcto

29 MODELO DEL AJUSTE INDUCIDO
el centro activo adopta la conformación idónea sólo en presencia del sustrato. La unión del sustrato al centro activo de la enzima desencadena un cambio conformacional que da lugar a la formación del producto.

30 Modelos de la interacción E - S

31 Modelo del Ajuste Inducido

32 Cofactores - Coenzimas
A veces, una enzima requiere p/su función la presencia de sustancias no proteicas que colaboran en la catálisis: Los cofactores. Pueden ser iones inorgánicos como el Fe++, Mg++, Mn++, Zn++ etc. Casi un tercio de las enzimas conocidos requieren cofactores. Cuando el cofactor es una molécula orgánica se llama coenzima.

33 Cofactores - Coenzimas
Muchas de estas coenzimas se sintetizan a partir de vitaminas. Cuando los cofactores y las coenzimas se encuentran unidos covalentemente a la enzima se llaman grupos prostéticos. La forma catalíticamente activa de la enzima = holoenzima. La parte proteica de una holoenzima se llama apoenzima (inactiva), de forma que: apoenzima + grupo prostético= holoenzima

34 Coenzima: NAD+ Deriva de la Vitamina B5 (ácido nicotínico)

35 Coenzima: FAD Es grupo prostético Deriva de la Vitamina B2 (flavina)
FAD forma oxidada FADH2 forma reducida

36 CINÉTICA ENZIMÁTICA La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. La velocidad de una reacción catalizada por una enzima puede medirse con relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar la enzima. Estos estudios proporcionan información directa acerca del mecanismo de la reacción catalítica y de la especificidad de la enzima.

37 CINÉTICA ENZIMÁTICA

38 CINÉTICA ENZIMÁTICA MODELO CINÉTICO DE MICHAELIS-MENTEN
Finales del siglo XIX: estudios sistemáticos del efecto de la concentración inicial del sustrato s/la actividad enzimática. En 1882 se introdujo el concepto del complejo enzima-sustrato como intermediario del proceso de catálisis enzimática. En 1913, Leonor Michaelis y Maud Menten desarrollaron esta teoría y propusieron una ecuación de velocidad que explica el comportamiento cinético de las enzimas.

39 MODELO CINÉTICO DE MICHAELIS-MENTEN
v = v3 = k3 [ES] = V = velocidad de la reacción catalizada por la enzima

40 La v de una reacción catalizada por una enzima puede medirse con relativa facilidad (en muchos casos no es necesario purificar o aislar la enzima). La medida se realiza siempre en: condiciones óptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc, C/concentraciones saturantes de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de reacción observada es la velocidad máxima (Vmax). Se expresa en aparición de los productos o la desaparición de los reactivos

41 MODELO CINÉTICO DE MICHAELIS-MENTEN CÁLCULO DE LA KM Y DE LA Vmax DE UN ENZIMA
v = v3 = k3 [ES]        V = velocidad de la reacción catalizada por la enzima La representación gráfica de la ecuación de Michaelis-Menten es una hipérbola . La Vmax corresponde al valor máximo al que tiende la curva experimental, y la KM corresponde a la concentración de sustrato a la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la Vmax.

42 El valor de KM da idea de la afinidad de la enzima por el sustrato:
La constante de Michaelis-Menten (KM) es un parámetro cinético importante por varias razones: KM = [S] para la cual la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima. El valor de KM da idea de la afinidad de la enzima por el sustrato: a menor KM, mayor afinidad del enzima por el sustrato, y a mayor KM, menor afinidad.

43 Hay enzimas que no obedecen la ecuación de Michaelis-Menten
Hay enzimas que no obedecen la ecuación de Michaelis-Menten. Se dice que su cinética no es Michaeliana. Esto ocurre con las enzimas alostéricas, cuya gráfica de v frente a [S] no es una hipérbola, sino una sigmoide En la cinética sigmoidea, pequeñas variaciones en la [S] en una zona crítica (cercana a la KM) se traduce en grandes variaciones en la velocidad de reacción.

44 Regulación de la actividad enzimática
Como ocurre con toda proteína, la actividad de una enzima depende de factores tales como: la temperatura, el pH, las disoluciones salinas, los solventes, los activadores y los inhibidores, el tiempo de reacción.

45 Factores que afectan la cinética enzimática
La actividad puede estar afectada por: pH - Temperatura - Fuerza iónica Inhibidores

46 La mayoría de las enzimas son muy sensibles a los cambios de pH.
Desviaciones de pocas décimas del pH óptimo pueden afectar drásticamente su actividad. Por ello, los seres vivos han desarrollado sistemas más o menos complejos para mantener estable el pH intracelular Efecto el pH Variaciones del pH del medio producen cambios en el estado de ionización de algunos grupos de una enzima, afectando su estructura tridimensional y su actividad. El cambio en la ionización de grupos químicos del sitio activo puede alterar el reconocimiento del sustrato o la reactividad de los AA del sitio activo. Todas las enzimas tienen dos valores límites de pH entre los cuales son efectivas, más allá se desnaturaliza y deja de actuar.

47 Efecto de la Temperatura
Factor temperatura Si aumenta la temperatura, aumenta la energía cinética de las partículas y su movilidad produciéndose un aumento en el número de colisiones y la velocidad de la transformación. Si la temperatura continúa aumentando, se comienzan a romper unio­nes intermoleculares (responsables de la conformación) y, así, comienza a disminuir su actividad. Si la TºC es excesiva, la enzima se desnaturaliza perdiendo totalmente sus propiedades catalíticas.

48 Factores que afectan la cinética enzimática: INHIBIDORES
Ciertas moléculas pueden inhibir la acción catalítica de una enzima: son los inhibidores. Irreversibles E + I  EI se unen fuertemente a la E y el complejo no se disocia Reversibles E + I ⇄ EI

49 Inhibidores Reversibles
Pueden actuar de 3 modos: ocupan temporalmente el centro activo por semejanza estructural con el S original: inhibidor competitivo Se unen a otro sitio en la Enz y alteran su conformación espacial, impidiendo su unión al S: inhibidor no competitivo Se unen al complejo E-S impidiendo la catálisis del sustrato: inhibidor acompetitivo

50 Inhibidores Reversibles inhibidor competitivo

51 Inhibidores Reversibles inhibidor no competitivo

52 Inhibidores Reversibles inhibidor acompetitivo

53 Inhibidores Reversibles inhibidor acompetitivo

54 Regulación de la catálisis enzimática
las concentraciones del sustrato y de los productos finales presencia de inhibidores modulación alostérica modificación covalente activación por proteolisis (zimógenos) isoenzimas

55 MODULACIÓN ALOSTÉRICA DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Hay enzimas que pueden adoptar 2 conformaciones interconvertibles llamadas R (relajada) y T (tensa). R es la forma más activa porque se une al sustrato con más afinidad. Las formas R y T se encuentran en equilibrio R <==> T

56 Enzima alostérica

57 ACTIVADORES ALOSTÉRICOS
Ciertas sustancias tienden a estabilizar la forma R actuando s/una región de la Enz distinta del centro activo. Son los llamados moduladores positivos ó activadores alostéricos. El propio S es a menudo un modulador positivo.

58 INHIBIDORES ALOSTÉRICOS
Las sustancias que favorecen la forma T y actúan en lugares distintos del centro activo de la enzima y disminuyen la actividad enzimática: son los moduladores alostéricos negativos.

59 Regulación de la actividad enzimática por MODIFICACIÓN COVALENTE
Hay enzimas que pasan de la forma inactiva a la activa por unión covalente a un grupo químico de pequeño tamaño como el Pi o el AMP. También se da el caso inverso (E activa -> E inactiva) El enzima no fosforilado es inactivo El enzima fosforilado es activo

60 Regulación de la actividad enzimática por ACTIVACIÓN PROTEOLÍTICA
Algunos enzimas no se sintetizan como E activa, sino como proteínas precursoras sin actividad enzimática. Estas proteínas se llaman proenzimas o zimógenos. Para activarse, los zimógenos sufren hidrólisis que origina la liberación de uno o varios péptidos. El resto de la molécula proteica adopta la conformación y las propiedades de la enzima activa. Ej.: enzimas digestivas se secretan en forma de zimógenos y en el tubo digestivo se convierten en la forma activa. Es el caso de la quimotripsina, que se sintetiza en forma de quimotripsinógeno

61 Regulación de la actividad enzimática por ACTIVACIÓN PROTEOLÍTICA

62 REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR MEDIO DE ISOENZIMAS
Algunos enzimas tienen distinta estructura molecular aunque su función biológica es similar. Se llaman isozimas o isoenzimas. Estas diferencias de estructura se traducen en ligeros cambios en sus propiedades, de forma que cada isozima se adapta perfectamente a la función que debe realizar. Así, podemos observar la existencia de isoenzimas en función de: el tipo de tejido: Por ejemplo, la lactato deshidrogenasa presenta isoezimas distintas en músculo y corazón. el compartimento celular donde actúa: Por ejemplo, la malato deshidrogenasa del citoplasma es distinta de la de la mitocondria. el momento concreto del desarrollo del individuo. Ej: algunos enzimas de la glicolisis del feto son diferentes de los mismos enzimas en el adulto.

63 APOENZIMA