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12. Ciclo celular y crecimiento de poblaciones microbianas Crecimiento a nivel individual. Crecimiento de poblaciones: medida de masa y nº de células.

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1 12. Ciclo celular y crecimiento de poblaciones microbianas Crecimiento a nivel individual. Crecimiento de poblaciones: medida de masa y nº de células. Crecimiento balanceado. Cultivo continuo. Curva de crecimiento en sistema cerrado

2 Introducción al crecimiento microbiano (I) Crecimiento: incremento ordenado de todos los componentes del sistema biológico aumento de la masa celular multiplicación celular En microorganismos que se dividen por fisión o por gemación aumento del nº de individuos En microorganismos cenocíticos aumento del tamaño de la colonia cenocítica

3 Introducción al crecimiento microbiano (II) Puntos de vista de estudio: Individual: ciclo celular Replicación y segregación de cromosomas Síntesis de nuevos materiales de las envueltas (ver tema 5) Coordinación de la replicación y la división celular Poblacional Cinética del crecimiento Factores que afectan al tiempo de generación (g) Factores ambientales que afectan al crecimiento Físicos (tema 13) Químicos (tema 14)

4 Ciclo celular Secuencia de acontecimientos identificables que ocurren desde que surge una nueva célula hasta que ésta se divide en dos hijas En el ciclo procariótico existen períodos C: replicación del ADN cromosómico D: formación del septo y división celular Fase innominada, equivalente a la G 1 eucariótica C y D son relativamente constantes cuando disminuye g lo hace a expensas de G 1

5 Ciclo celular en función del tiempo de generación g>C+D: existe G 1 (intervalo antes de la replicación). C y D están perfectamente diferenciados g=C+D: no existe G 1. Cada ronda de replicación empieza al terminar una división celular g

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7 Control del ciclo celular en Escherichia coli (I) Dos secuencias paralelas de acontecimientos controlan el ciclo: Un control es sensible a una masa celular umbral, y está implicado en desencadenar la replicación cromosómica Otro control es sensible a una longitud celular umbral, y tiene que ver con el reparto de los cromosomas y la formación del tabique

8 Fase CFase D

9 Control del ciclo celular en Escherichia coli (II) Inicio de la replicación (sensible a masa umbral): Unidades de DnaA (+ATP) se unen a oriC. El oriC tras la replicación queda hemimetilado, y queda secuestrado en la membrana (para evitar la acción de la metilasa Dam) Inicio de tabicación (sensible a longitud umbral y a la separación de los cromosomas): Formación en el centro celular de un círculo de FtsZ, que se va contrayendo Ensamblaje en ese plano del divisoma, incluyendo la PBP3 síntesis de PG del tabique

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11 Medida del crecimiento por masa celular (I) Métodos directos: Determinación del peso húmedo Determinación del peso seco Determinación del N total Determinación de algún componente característico: PG ADN, ARN Proteínas ATP Clorofilas (en fotosintéticos)

12 Medida del crecimiento por masa celular (II) Métodos indirectos: Consumo de nutrientes QO 2 (consumo de oxígeno) QCO 2 (consumo de dióxido de carbono) Producción de ciertos metabolitos Producción de ácidos orgánicos Métodos turbidimétricos (ópticos): Espectrofotómetro (mide luz transmitida) Nefelómetro (mide luz dispersada)

13 Espectrofotómetro en medida del crecimiento

14 Medida del número de individuos (I) Métodos directos: Cámara de Petroff-Hauser (para bacterias) Cámara de Thoma (para levaduras y células mayores que las bacterianas) Contadores electrónicos de partículas (contador Coulter)

15 Cámara de Petroff-Hauser

16 Medida del número de individuos (II) Métodos indirectos: Recuento de viables por siembra de muestras de diluciones en placas de Petri Recuento de viables a partir de grandes volúmenes de suspensiones diluidas: se hacen pasar por filtros de nitrocelulosa o equivalentes (ej.: sistema Millipore ® ), y se incuban sobre medio sólido

17 Dispersión sobre la superficie de placas Petri Medio en sobrefusión se añade a una muestra

18 Alícuotas 0.1 ml 10 x 10 6 Recuento de viables por siembra en placas Petri

19 Sistema de filtración en membrana de Millipore ®

20 Filtración por membrana de Millipore ® de una muestra

21 Crecimiento balanceado (=equilibrado) (I) El incremento por unidad de tiempo constituyentes de la población es un valor constante y similar en cada caso: velocidad de aumento del componente = K · [cantidad de ese componente] (cinética orden 1) Es decir: el nº de células, la masa u otros componentes se duplican en un mismo lapso de tiempo tiempo de generación (g)

22 Crecimiento balanceado (=equilibrado) (II) Otra manera: todos los constituyentes aumentan proporcionalmente por un mismo factor en la unidad de tiempo coeficiente exponencial de crecimiento μ Se deduce fácilmente la relación entre μ y el tiempo de generación (g): μ = 0.693/g (en h -1 )

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25 Cultivo continuo (sistema abierto) cultivo balanceado mantenido por tiempo indefinido por un sistema abierto de flujo compuesto por: Una cámara de cultivo de volumen constante A la que llega un suministro de nutrientes desde una cámara reservorio Desde la cámara de cultivo se elimina parte del cultivo y de sustancias tóxicas por un dispositivo de rebosadero

26 Medio fresco desde reservorio Válvula para controlar el flujo f (en ml/h) v x Pérdida neta céls: -dx/dt = x·D Crecimiento bruto: dx/dt = x· μ Crecimiento neto: dx/dt = x· μ - x·D = = x (μ-D) En equilibrio μ = D; luego dx/dt = 0 y x se hace constante D = f/v (en h -1 )

27 SRSR D = f/v v Reservorio de medio fresco, con un sustrato limitante (S R ) Válvula de control del flujo Suministro de aire Filtro de aire Cámara de cultivo Receptor del efluente rebosado

28 g x DCDC DMDM

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30 Crecimiento en sistemas cerrados líquidos El más habitual en laboratorio Cultivo en frascos, tubos, etc. No hay aporte nuevo de nutrientes ni es posible eliminar los productos de desecho del cultivo Se desarrolla a través de una curva característica de crecimiento7

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