12. Ciclo celular y crecimiento de poblaciones microbianas

Presentación del tema: "12. Ciclo celular y crecimiento de poblaciones microbianas"— Transcripción de la presentación:

1 12. Ciclo celular y crecimiento de poblaciones microbianas
Crecimiento a nivel individual. Crecimiento de poblaciones: medida de masa y nº de células. Crecimiento balanceado. Cultivo continuo. Curva de crecimiento en sistema cerrado En este tema veremos: Crecimiento a nivel individual. Crecimiento de poblaciones: medida de masa y nº de células. Crecimiento balanceado. Cultivo continuo. Curva de crecimiento en sistema cerrado líquido. Crecimiento en sistema cerrado sólido.

2 Introducción al crecimiento microbiano (I)
Crecimiento: incremento ordenado de todos los componentes del sistema biológico  aumento de la masa celular  multiplicación celular En microorganismos que se dividen por fisión o por gemación  aumento del nº de individuos En microorganismos cenocíticos  aumento del tamaño de la colonia cenocítica Se suele definir el crecimiento de cualquier sistema biológico como el incremento ordenado de todos los elementos componentes de ese sistema, lo cual implica un aumento de la masa celular que eventualmente conduce a la multiplicación celular. En organismos pluricelulares dicha multiplicación se traduce en un aumento del tamaño del individuo, mientras que en unicelulares que se dividen por fisión o por gemación, lo que ocurre es un aumento de la población. En los microorganismos cenocíticos (en los que la duplicación del genoma no se acompaña de divisón celular) el crecimiento se traduce en aumento de tamaño de la “colonia” cenocítica.

3 Introducción al crecimiento microbiano (II)
Puntos de vista de estudio: Individual: ciclo celular Replicación y segregación de cromosomas Síntesis de nuevos materiales de las envueltas (ver tema 5) Coordinación de la replicación y la división celular Poblacional Cinética del crecimiento Factores que afectan al tiempo de generación (g) Factores ambientales que afectan al crecimiento Físicos (tema 13) Químicos (tema 14) El crecimiento bacteriano podemos estudiarlo desde dos puntos de vista: ·  A escala individual · A escala poblacional Los eventos de crecimiento en el ámbito individual hacen referencia al ciclo celular, y dentro de éste podemos abordar los siguientes temas: · inicio y transcurso de la replicación cromosómica y de plásmidos (véase tema 7); · segregación de cromosoma y plásmidos a las células hijas; · síntesis de nuevos materiales de las envueltas, sobre todo de pared celular (tema 5); · señales que coordinan la replicación genómica con la división celular. El estudio del crecimiento a nivel de poblaciones incluye los siguientes tópicos: · cinética del crecimiento; · factores que afectan al tiempo de generación (g); · factores ambientales que limitan el crecimiento.

4 Ciclo celular Secuencia de acontecimientos identificables que ocurren desde que surge una nueva célula hasta que ésta se divide en dos hijas En el ciclo procariótico existen períodos C: replicación del ADN cromosómico D: formación del septo y división celular Fase innominada, equivalente a la G1 eucariótica C y D son relativamente constantes  cuando disminuye g lo hace a expensas de G1 Un ciclo celular es una secuencia de acontecimientos interconectados que comienza con la formación de una nueva célula y termina cuando dicha célula se divide en otras dos hijas. Los ciclos celulares se describen generalmente atendiendo a una serie de eventos identificables que se van produciendo en una secuencia fija, de modo que para que se produzca cada uno de ellos hace falta que se complete el anterior. Los periodos del ciclo celular procariótico son: · fase C (equivalente a la S eucariótica): replicación del ADN cromosómico; · fase D (equivalente a G2 + M): se distingue porque su terminación coincide con el final de división celular; · fase innominada, equivalente a la G1 eucariótica. Lo característico del ciclo es que las fases C y D son relativamente constantes, y por lo tanto, cuando disminuye el tiempo de generación (g), lo hace a expensas de la fase “G1”. Por ejemplo, en Escherichia coli, C = unos 40 min, y D = unos 20 min. Una característica del ciclo es que, cuanto más rico es un medio, y por lo tanto menor es el tiempo de generación (g), mayor es el tamaño medio de las células. Es decir, los individuos de una cepa bacteriana que esté en un medio rico son más grandes que los individuos de esa misma cepa creciendo en un medio pobre.

5 Ciclo celular en función del tiempo de generación
g>C+D: existe G1 (intervalo antes de la replicación). C y D están perfectamente diferenciados g=C+D: no existe G1. Cada ronda de replicación empieza al terminar una división celular g<C+D: rondas de replicación de un ciclo empiezan antes de que haya terminado la división celular del ciclo anterior (C y D parcialmente superpuestas) g<C: no se detecta fase D. La síntesis de ADN es continua en todo el ciclo. Replicación dicotómica de los cromosomas Vamos a estudiar con el ejemplo de E. coli qué ocurre con el ciclo celular a distintos tiempos de generación. Cuando g>C+D: Existe fase "G1" (intervalo que precede a la replicación). En estas condiciones podemos observar nítidamente periodos diferenciados entre sí (de síntesis de ADN y de división celular). Cuando g=C+D: Ya no existe G1, y cada ronda de replicación comienza inmediatamente tras la precedente división celular (es decir, cada célula hija recién nacida se embarca inmediatamente en replicar el cromosoma, y una vez que ha terminado de replicarlo, la célula inicia la división celular). Cuando g<C+D: Las rondas de replicación de un ciclo se inician antes de que haya terminado la división celular del anterior (superposición parcial entre fases C y D). Cuando g<C: Ya no se puede detectar fase D como tal. La síntesis de ADN es continua durante todo el ciclo. Se inician rondas de replicación cromosómica antes de que haya terminado la anterior. Esto se traduce en que los cromosomas muestran un típico patrón de replicación dicotómica y en que dichos cromosomas pasan a cada célula hija ya embarcados en una nueva ronda de replicación.

6 Esquema simplificado del crecimiento de una bacteria bacilar: la célula crece en tamaño, duplica el cromosoma, las copias del cromosoma se repararten a partes separadas, se forma el tabique y surgen dos células hijas.

7 Control del ciclo celular en Escherichia coli (I)
Dos secuencias paralelas de acontecimientos controlan el ciclo: Un control es sensible a una masa celular umbral, y está implicado en desencadenar la replicación cromosómica Otro control es sensible a una longitud celular umbral, y tiene que ver con el reparto de los cromosomas y la formación del tabique De lo anterior se deduce que debe de existir algún tipo de acoplamiento entre las ondas de replicación y la división celular. Este es un campo de investigación aún joven, del que no conocemos todavía todos los detalles. Las copias de cromosomas recién replicadas se encuentran en principio adyacentes de la membrana citoplásmica (¿unidas a sendos mesosomas?) probablemente unidas a través de sus respectivos orígenes de replicación (oriC). No se sabe muy bien cómo esas copias se van separando de modo que cada una va a parar a una célula hija. Se sabe que en este reparto o partición de los cromosomas intervienen varias proteínas, entre ellas ParA y ParB, que en las células a punto de dividirse se sitúan en los dos polos opuestos. Es posible que exista algún mecanismo “activo” para separar estos cromosomas, pero parece ser que también intervienen los mecanismos “pasivos” de crecimiento de membrana y pared celular en el tabique transversal en crecimiento. También se sabe hoy que existen dos secuencias paralelas e independientes de acontecimientos que controlan el ciclo celular: un control es sensible a una masa umbral celular para desencadenar el inicio de la replicación del cromosoma, y el otro responde a cierta longitud umbral (en el caso de los bacilos) para que ocurra el reparto de los cromosomas y la formación del tabique. (Ver siguiente diapositiva).

8 Esquema de las dos series independientes de acontecimientos que disparan la replicación cromosómica y la formación del tabique transversal, con la división final. Fase C Fase D

9 Control del ciclo celular en Escherichia coli (II)
Inicio de la replicación (sensible a masa umbral): Unidades de DnaA (+ATP) se unen a oriC. El oriC tras la replicación queda hemimetilado, y queda “secuestrado” en la membrana (para evitar la acción de la metilasa Dam) Inicio de tabicación (sensible a longitud umbral y a la separación de los cromosomas): Formación en el centro celular de un círculo de FtsZ, que se va contrayendo Ensamblaje en ese plano del divisoma, incluyendo la PBP3  síntesis de PG del tabique · El comienzo de la replicación del cromosoma se indica mediante la unión de muchas unidades de la proteína DnaA (unida a ATP) al origen de replicación (oriC). Una vez que se ha iniciado una ronda de replicación en oriC, esta región queda hemimetilada, pero en vez de ser metilada inmediatamente, queda secuestrada u ocultada a efectos de la metilasa Dam y de la maquinaria de replicación. Se sugiere que en este fenómeno está implicada una proteína (SeqA), que a su vez ayudaría a esconder a oriC en la membrana. Sólo más tarde (y por factores desconocidos, pero que puede que tengan que ver de nuevo con la proporción entre sitios de inicio y algún parámetro celular como masa o volumen), vuelven a quedar las secuencias oriC disponibles para su metalición y uso en una nueva ronda. · El comienzo de la tabicación parece que requiere dos señales: por un lado, el cromosoma ha debido terminar su replicación y las copias hijas deben de estar separadas en extremos opuestos, y por otro, la célula debe haber alcanzado una longitud umbral.

10 Llegado el momento, la proteína FtsZ (que hasta entonces estaba diseminada por toda la célula), se concentra ahora en la parte central, señalando el plano de la tabicación: se forma un “anillo citocinético” o divisoma, en el que la FtsZ se va “contrayendo” hacia el interior (hidrolizando GTP hasta GDP). A continuación se van ensamblando en el divisoma varias proteínas Fts, entre ellas la PBP3, que como vimos es una transglucosidasa-transpeptidasa específica del tabique, que va produciendo peptidoglucano en el septo transversal. La terminación del tabique señala el final del ciclo celular. Observa en la secuencia de imágenes de abajo (3ª y 4ª fila) cómo la proteína FtsZ (teñida de rojo) se encuentra repartida en un principio por toda la célula, pero luego se concentra en el plano central, para señalizar el comienzo de la formación del tabique por medio del divisoma.

11 Medida del crecimiento por masa celular (I)
Métodos directos: Determinación del peso húmedo Determinación del peso seco Determinación del N total Determinación de algún componente característico: PG ADN, ARN Proteínas ATP Clorofilas (en fotosintéticos) En estos métodos directos de medida de la masa se requieren preparaciones limpias, sin partículas extrañas. 1) Determinación del peso húmedo: se tara un tubo de centrífuga; se centrifuga el cultivo y se elimina el sobrenadante; se determina el peso del sedimento.Inconvenientes: grandes errores, debido al líquido intercelular retenido, cuya cuantía depende a su vez de la forma y tipo de agrupaciones de la cepa, intensidad del empaquetamiento, etc.  2) Determinación del peso seco: como el anterior, pero el sedimento se seca antes de ser pesado (105ºC, toda la noche), hasta peso constante. Las medidas de peso seco suelen representar el 10-15% de los valores de peso húmedo.Inconvenientes: método tedioso (requiere mucho tiempo) y con bastantes errores: es difícil pesar menos de 1 mg con exactitud en las balanzas habituales de laboratorio. 1 mg de peso seco equivale a unas 5x109 bacterias. 3) Determinación del nitrógeno total: técnica de micro-Kjeldahl. 4) Determinación de un componente característico: peptidoglucano, ADN, ARN, proteínas, ATP, clorofilas en organismos fotosintéticos, etc. Comentarios: se suele usar en bacterias para las que otros métodos más fáciles dan errores debido a que forman grumos no dispersables, crecen en filamentos, etc. Se emplean en determinaciones de crecimientos en ambientes naturales.

12 Medida del crecimiento por masa celular (II)
Métodos indirectos: Consumo de nutrientes QO2 (consumo de oxígeno) QCO2 (consumo de dióxido de carbono) Producción de ciertos metabolitos Producción de ácidos orgánicos Métodos turbidimétricos (ópticos): Espectrofotómetro (mide luz transmitida) Nefelómetro (mide luz dispersada) Métodos indirectos de medida de la masa:  1) Medida de consumo de nutrientes o de producción de algún metabolito por unidad de tiempo . Ejemplos: consumo de oxígeno (QO2) y consumo de carbónico (QCO2), determinados por el respirómetro de Warburg. Producción de ácidos. 2) Métodos turbidimétricos (ópticos). Son muy usados en la práctica cotidiana del laboratorio. La base común de estos métodos consiste en la medición de la cantidad de luz dispersada o transmitida a través de un cultivo bacteriano.  a) Espectrofotómetro: Este aparato es de uso habitual en cualquier laboratorio de Microbiología o Bioquímica. Mide la densidad óptica (D.O.), es decir la absorbancia. Por supuesto, hay que realizar una curva estándar para relacionar los valores de A con la masa bacteriana en una muestra problema. Comentarios: La cantidad de luz dispersada es proporcional al cociente entre el tamaño de la partícula y la longitud de onda incidente; la sensibilidad de la técnica aumenta pues a longitudes de onda () cortas. La proporcionalidad entre A y masa bacteriana sólo es válida para >107céls/ml.  b) Nefelómetro: Es un aparato similar al anterior, pero el dispositivo sensor está situado en ángulo recto respecto de la dirección de la luz incidente, y lo que se mide es pues, la luz dispersada directamente por la preparación. Posee mayor sensibilidad que el espectrofotómetro.

13 Espectrofotómetro en medida del crecimiento
Esquema del espectrofotómetro para la medida de la densidad óptica de un cultivo microbiano. Observa que, a diferencia del nefelómetro, este aparato compara la luz original con la luz transmitida a través del cultivo.

14 Medida del número de individuos (I)
Métodos directos: Cámara de Petroff-Hauser (para bacterias) Cámara de Thoma (para levaduras y células mayores que las bacterianas) Contadores electrónicos de partículas (contador Coulter) Métiodos directos de medida del número de células:  1) Cámara de recuento de Petroff-Hauser: Consiste en un portaobjetos especial con una graduación en superficie y unas medidas muy concretas: · excavación con 0.02 mm de profundidad; · área de 1 mm2, dividida en un retículo de 25 cuadrados grandes; · cada cuadrado grande está subdividido a su vez en 4x4 = 16 cuadrados pequeños. · O sea, la muestra se distribuye en 16 x 25 = 400 celdillas (cuadros pequeños). La muestra, una vez dispensada entre el porta y el cubre, se deja reposar sobre la plataforma del microscopio durante unos minutos, y se cuenta el número de células en varias celdillas (normalmente en 16, equivalentes a uno de los cuadros grandes). Se anota el número n de células observadas en esas 16 celdillas. Entonces, la concentración celular es fácil de establecer: n x 25 x 50 x 1000 = concentración en células/ml. 2) Contadores electrónicos de partículas (tipo Coulter): Se hace pasar una suspensión microbiana por un tubo capilar, entre los dos polos de una corriente eléctrica. Cada vez que por un orificio (30 m diámetro) pasa una partícula (p. ej., bacteria) se interrumpe la corriente, lo cual es recogido por un dispositivo de registro electrónico, que detecta el número y el tamaño de las partículas que van pasando. (El tamaño detectado es función de la intensidad del pulso de voltaje al paso de la partícula).

15 Cámara de Petroff-Hauser
Recuento microscópico directo de bacterias con la cámara de Petroff-Hauser. Consiste en un portaobjetos especial con una graduación en superficie y unas medidas muy concretas: · excavación con 0.02 mm de profundidad; · área de 1 mm2, dividida en un retículo de 25 cuadrados grandes; · cada cuadrado grande está subdividido a su vez en 4x4 = 16 cuadrados pequeños. · O sea, la muestra se distribuye en 16 x 25 = 400 celdillas (cuadros pequeños). La muestra, una vez dispensada entre el porta y el cubre, se deja reposar sobre la plataforma del microscopio durante unos minutos, y se cuenta el número de células en varias celdillas (normalmente en 16, equivalentes a uno de los cuadros grandes). Se anota el número n de células observadas en esas 16 celdillas. Entonces, la concentración celular es fácil de establecer: n x 25 x 50 x 1000 = concentración en células/ml.

16 Medida del número de individuos (II)
Métodos indirectos: Recuento de viables por siembra de muestras de diluciones en placas de Petri Recuento de viables a partir de grandes volúmenes de suspensiones diluidas: se hacen pasar por filtros de nitrocelulosa o equivalentes (ej.: sistema Millipore®), y se incuban sobre medio sólido Medidas indirectas del número de microorganismos: 1) Recuento de viables en placa: Los métodos de recuento de número de células que hemos visto hasta ahora (los directos) no distinguen entre células vivas y muertas. En muchos casos conviene contar las células vivas, y esto en laboratorio se suele hacer mediante el recuento de viables. (Una célula se define como viable cuando, colacada en un medio adecuado, es capaz de dividirse y dar descendencia). El método habitual de lograr esto es sembrar pequeñas alícuotas de diluciones adecuadas de un cultivo original sobre placas de Petri con medio sólido (con agar). Cada célula viable dará origen a una colonia visible después del tiempo adecuado de incubación. Contando las colonias visibles, teniendo en cuenta la dilución de la que proceden y el volumen de alícuota utilizado, es fácil deducir el número de células viables en la suspensión original. (Para esto, mira el ejemplo de la diapositiva siguiente, y sobre todo, estáte atento a la práctica correspondiente, que se suele realizar en la 3ª tanda). 2) Recuento sobre filtros: Se usa para suspensiones diluidas de bacterias. Se hace pasar un gran volumen de suspensión a través de una membrana de nitrocelulosa o de nylon estériles (con un diámetro de poro que retiene las bacterias pero permite el tránsito de sustancias). Posteriormente, el filtro se deposita sobre la superficie de un medio de cultivo sólido. Las colonias se forman sobre el filtro a partir de las células retenidas. Dichas colonias se cuentan, deduciéndose la concentración original de viables en función del volumen de suspensión que se hizo pasar por el filtro.

17 Dispersión sobre la superficie de placas Petri
Modo de sembrar bacterias en placa: el más habitual es el de arriba, en el que una alícuota pequeña (normalmente 0.1 ml) se añade a la superficie del medio sólido de una placa Petri, y se dispersa uniformemente por toda esa superficie mediante la espátula de vidrio estéril. Medio en sobrefusión se añade a una muestra

18 Recuento de viables por siembra en placas Petri
Alícuotas 0.1 ml Ejemplo de un recuento de viables en placa. A partir de un cultivo original se van haciendo diluciones decimales seriadas, y de ellas se siembran alícuotas de 0.1 ml en placas de Petri. Se cuentan las placas que tengan entre 50 y 300 colonias, y se deduce el número de unidades formadoras de colonias por ml (CFU/ml). Precauciones con esta técnica: · para minimizar los errores estadísticos de muestreo, se recomienda sembrar 5 placas de cada dilución; · hay que usar pipetas nuevas en cada dilución; · contar las placas donde existan entre 50 y 300 colonias. · Como no podemos garantizar que cada colonia no proceda de más de un indiviudo (y esto es especialmente cierto para bacterias que forman agrupaciones de 2 o más células), el recuento se refiere no a “células viables reales” sino a “unidades formadoras de colonia” (UFC). Por lo tanto, una UFC corresponde, como mínimo, a una bacteria, pero sobre todo en bacterias con agrupaciones, la medida por siembr en placa infravalora el número real de individuos, porque cada UFC puede corresponder a dos o más individuos que estaban juntos al ser sembrados en la placa. 106 10 x

19 Sistema de filtración en membrana de Millipore®
Sistema de filtración por membrana de la marca Millipore, muy usado en Microbiología. Hay un receptáculo superior que se aprieta al inferior. Entre ambos se coloca un filtro estéril (de nylon o de nitrocelulosa), cuyo tamaño de poro retiene las bacterias, pero deja pasar el medio de cultivo.

20 Filtración por membrana de Millipore® de una muestra
Procedimiento de filtración por membrana: una vez que se ha hecho pasar un cultivo diluidos a través del sistema, recogemos el filtro con unas pinzas, y lo depositamos sobre la superficie de una placa de Petri con medio sólido. Los nutrientes pasan a través de los poros, de modo que al cabo del tiempo se formarán sobre el filtro tantas colonias como individuos quedaron retenidos a partir del filtrado del cultivo diluido original.

21 Crecimiento balanceado (=equilibrado) (I)
El incremento por unidad de tiempo constituyentes de la población es un valor constante y similar en cada caso: velocidad de aumento del componente = K · [cantidad de ese componente] (cinética orden 1) Es decir: el nº de células, la masa u otros componentes se duplican en un mismo lapso de tiempo  tiempo de generación (g) Una población de bacterias que se encuentre en un medio adecuado en el que se mantienen constantes todos sus parámetros nutricionales y ambientales, crece de forma tal que el incremento por unidad de tiempo de masa celular, no de células, ADN, ARN, proteínas, etc., es un valor constante y similar en cada caso: M/M = N/N = [ADN]/[ADN] = [proteínas]/[proteínas] = ... = K Así pues, durante este crecimiento, de tipo exponencial o logarítmico, el cultivo se comporta como una reacción autocatalítica de primer orden: velocidad de aumento del componente = K·{cantidad del componente} También se puede decir que el no de células, la masa celular u otros componentes se duplican en un mismo lapso de tiempo determinado. Este tipo de crecimiento se denomina balanceado o equilibrado. Se caracteriza, pues, por ser el crecimiento en el que · todos los constituyentes celulares se duplican en un mismo tiempo,

22 Crecimiento balanceado (=equilibrado) (II)
Otra manera: todos los constituyentes aumentan proporcionalmente por un mismo factor en la unidad de tiempo  coeficiente exponencial de crecimiento μ Se deduce fácilmente la relación entre μ y el tiempo de generación (g): μ = 0.693/g (en h-1) Dicho de otra manera: · el crecimiento balanceado es aquel en el que estos constituyentes aumentan proporcionalmente por un mismo factor en la unidad de tiempo. Este factor es el coeficiente exponencial de crecimiento (), que es característico para cada cepa bacteriana en cada medio determinado. El valor del coeficiente de crecimiento exponencial en función del tiempo de generación es: μ = 0.693/g (expresado en h-1 ).

23 Tasa de crecimiento de un cultivo microbiano: (a) datos de una población que se duplica cada media hora (g=30 min). (b) Datos representados en una escala aritmética (curva verde, ordenada de la izquierda) y en una escala semilogarítmica (curva roja, ordenada de la derecha).Observa que es más cómodo usar la escala semilogarítmica. El tiempo de generación puede deducirse fácilmente de este tipo de representaciones, como veremos en la siguiente diapositiva.

24 Método para estimar los tiempos de generación (g) de dos cultivos en cremiento balanceado. En (a) se muestra un cultivo del que se puede decucir que g = 6 horas. En (b) se deduce que el cultivo crece con un valor g = 2 horas.

25 Cultivo continuo (sistema abierto)
cultivo balanceado mantenido por tiempo indefinido por un sistema abierto de flujo compuesto por: Una cámara de cultivo de volumen constante A la que llega un suministro de nutrientes desde una cámara reservorio Desde la cámara de cultivo se elimina parte del cultivo y de sustancias tóxicas por un dispositivo de rebosadero El cultivo continuo es un cultivo balanceado mantenido por tiempo indefinido por un sistema abierto de flujo que se compone de: · una cámara de cultivo de volumen constante, ·  a la que llega un suministro de nutrientes, · y de la que se eliminan o separan los productos tóxicos de desecho (por un dispositivo de rebosadero).   Una vez que el sistema alcanza el equilibrio, el número de células y la concentración de nutrientes en la cámara permanecen constantes, y entonces se dice que el sistema está en estado estacionario, con las células creciendo exponencialmente. Los parámetros a tener en cuenta son: ·   flujo (f), medido en ml/h ·  volumen de la cámara de cultivo (v, en ml) · densidad celular en la cámara (x) ·  factor de dilución D = f/v (en h--1).

26 Medio fresco desde reservorio Válvula para controlar el flujo
f (en ml/h) Pérdida neta céls: dx/dt = x·D Crecimiento bruto: dx/dt = x· μ Crecimiento neto: dx/dt = x· μ - x·D = = x (μ-D) En equilibrio μ = D; luego dx/dt = 0 y x se hace constante D = f/v (en h-1) v Los parámetros a tener en cuenta son: ·   flujo (f), medido en ml/h ·  volumen de la cámara de cultivo (v, en ml) · densidad celular en la cámara (x) ·  factor de dilución D = f/v (en h--1). Existe una pérdida de células por el rebosadero: -dx/dt = x·D El crecimiento bruto es dx/dt = x· Por lo tanto, el crecimiento neto es dx/dt = x· - x·D = x·( - D) Si logramos que el coeficiente de crecimiento () se haga igual al factor de dilución (D), entonces dx/dt = 0, y por lo tanto la concentración de células se hace constante (x= x). El cultivo se encuentra entonces en estado dinámico de equilibrio. Las pérdidas de células por drenaje se compensan con las ganancias por crecimiento. x f (en ml/h)

27 Receptor del efluente rebosado
Reservorio de medio fresco, con un sustrato limitante (SR) SR Válvula de control del flujo D = f/v Suministro de aire Una de las maneras de lograr un cultivo continuo es mediante el llamado quimiostato: en el quimiostato podemos controlar de modo independiente la densidad de la población celular y la velocidad de crecimiento del cultivo. La densidad celular en el equilibrio se controla ajustando el factor de dilución (D), mientras que la velocidad de crecimiento se controla variando la concentración del nutriente limitante en la cámara reservorio (SR). · En un quimiostato, los microorganismos pueden cultivarse a una amplia variedad de tasas de crecimiento exponencial · El quimiostato permite crecimientos balanceados restringidos debido a que existe un nutriente o sustrato presente en una concentración suficientemente baja como para limitar la densidad de población. · Así pues, el quimiostato también permite elegir la densidad de células a la que se quiere trabajar. (Mira el gráfico de la diapositiva siguiente). Filtro de aire Cámara de cultivo v Receptor del efluente rebosado

28 x g DM DC Algunos comentarios sobre el gráfico:
· La densidad del cultivo es muy similar en un amplio margen de tasas de dilución (D). Este margen es el más adecuado para hacer estudios en el quimiostato. En cambio, el valor de tiempo de generación (g) varía ampliamente. O sea, el quimiostato puede obtener tasas de crecimiento muy diferentes, sin que se afecte la densidad celular.Sin embargo, a valores extremos de dilución, se puede ver que el equilibrio se rompe: · A altas tasas de dilución la concentración microbiana cambia rápidamente, y en un margen estrecho el cultivo puede drenarse totalmente (DC: dilución crítica). Es decir, el cultivo se “lava” porque su velocidad de crecimiento es inferior a la tasa de dilución. · A muy bajas diluciones (DM) el quimiostato no funciona si el nutriente limitante es la fuente de energía. Ello se debe a que en esas condiciones, la fuente de energía sólo se usa para reacciones de mantenimiento de la integridad celular, pero no queda para el crecimiento. A este valor lo llamamos energía de mantenimiento. Los procesos relacionados con esta energía de mantenimiento son el potencial de membrana, el transporte de solutos y la renovación de proteínas. DM DC

29 Gráfico similar al anterior, pero en el que se puede ver también cómo evoluciona la concentración del nutriente en el quimiostato en función de la tasa de dilución. Aplicaciones del cultivo continuo en quimiostato: · Aportan una fuente continua de células en fase exponencial, lo que se aplica a procesos industriales de fermentación (producción de bebidas alcohólicas, de antibióticos, de aminoácidos, etc). · En el quimiostato, el crecimiento a bajas concentraciones de sustrato permite estudiar: aspectos fisiológicos (por ejemplo, catabolismo del sustrato limitante); selección de mutantes y estudios ecológicos. 

30 Crecimiento en sistemas cerrados líquidos
El más habitual en laboratorio Cultivo en frascos, tubos, etc. No hay aporte nuevo de nutrientes ni es posible eliminar los productos de desecho del cultivo Se desarrolla a través de una curva característica de crecimiento7 En los sistemas cerrados (que pueden ser líquidos o sólidos), no existe aporte continuo de nutrientes, ni drenaje de células ni de sustancias de desecho. En estos sistemas la fase exponencial de crecimiento balanceado no restringido dura sólo unas cuantas generaciones, debido al agotamiento de nutrientes y/o a la acumulación de desechos.

31 4 6 7 5 3 1) Fase de retardo (fase “lag”): Es el período de tiempo durante el que el inóculo se adapta a las condiciones del medio fresco sobre el que se ha sembrado. Se trata de un período de ajuste metabólico. Su duración depende de varios factores: tamaño del inóculo; bondad del inóculo (estado metabólico previo del inóculo); medio del que procede el inóculo (si el medio es similar al medio fresco, el lag es más corto; si el medio del inóculo era un medio rico y el medio fresco es más pobre, la fase de retardo se hace más larga, porque las bacterias necesitan un tiempo adicional para activar la síntesis de las enzimas biosintéticas que estaban reprimidas en el medio rico).  2) Fase de transición, de crecimiento acelerado, que conduce a …3) Fase de crecimiento exponencial (= fase logarítmica). La fase 2 se debe a que cada célula entra en la fase exponencial con desfase respecto de sus compañeras. Ello demuestra que las células del inóculo no están todas en las mismas condiciones fisiológicas. Durante la fase logarítmica se da un crecimiento balanceado no restringido durante unas pocas generaciones (normalmente menos de 10). El tiempo de generación (g) es característico para cada especie o cepa, en cada medio concreto: El valor del tiempo de generación (g) depende de composición del medio, temperatura, pH, osmolaridad (tonicidad), etc. 4) Fase de aceleración negativa, de crecimiento desequilibrado, que conduce a… (sigue texto en siguiente diapositiva) 2 1

32 5) Fase estacionaria: Esta fase se caracteriza porque el coeficiente neto de crecimiento se hace nulo ( = 0), pero aún existe crecimiento. Lo que ocurre es que el crecimiento bruto se equilibra con las muertes celulares. En este período se agotan nutrientes especiales y se acumulan sustancias de desecho. Incluso el pH del medio empieza a hacerse inadecuado para el crecimiento celular. Si la bacteria crece en un medio complejo, la fase 4 de transición (de aceleración negativa) puede ser relativamente larga, debido a que va recurriendo a fuentes alternativas (p. ej., puede recurrir a aminoácidos como fuente de C una vez agotados los hidratos de carbono). En la fase estacionaria aún existen reacciones metabólicas, pero el metabolismo general es diferente al de la fase logarítmica: las células son más pequeñas, debido a que existe división celular después de que se haya detenido el incremento de masa; suelen ser más resistentes a agentes físicos y químicos; existe reciclado de ciertos materiales intracelulares; baja el contenido en ARN. 6) Fase de transición hacia …7) Fase de muerte exponencial: Se da muerte y lisis masiva, exponencial, del cultivo. Se debe a agotamiento de reservas de energía. Algunas veces las células aparecen grandes, hinchadas, distorsionadas (formas “fantasmas”, “ghost”). La pendiente de esta parte de la curva depende de las especies (por ejemplo, en bacterias entéricas es suave, mientras que en Bacillus es más acentuada).