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INMOVILIZACIÓN POR ENTRECRUZAMIENTO (CROSSLINKING) Prof. J.M. Sánchez Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM.

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1 INMOVILIZACIÓN POR ENTRECRUZAMIENTO (CROSSLINKING) Prof. J.M. Sánchez Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

2 INMOVILIZACIÓN POR ENTRECRUZAMIENTO (CROSSLINKING) Prof. J.M. Sánchez Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

3 MODIFICACIÓN UNIPUNTUAL Prof. J.M. Sánchez Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

4 MODIFICACIÓN UNIPUNTUAL Prof. J.M. Sánchez Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

5 MODIFICACIÓN UNIPUNTUAL Prof. J.M. Sánchez Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

6 Modificaciones unipuntuales de interés Objetivo: hacer a la enzima insoluble en disoluciones acuosas. Uno de los métodos más tradicionales: UNIÓN COVALENTE DE UN POLÍMERO ANFIPÁTICO. El más habitual: monometoxipolietelienglicol (mPEG) Peso molecular variable. El mas usado: sobre 5 kDa. Dependiendo del grado de modificación, se consigue la total insolubilidad en agua. Este grado debe ser controlado cuidadosamente, pues puede conducir a la pérdida de actividad. La unión se suele hacer sobre lisinas. Prof. J.M. Sánchez Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

7 Uno de los más empleados. A través de TCT (cloruro cianúrico) Debe controlarse bien Copolímero con anh. succínico Enlace amida estable A través de un carbamato Se sigue fácilmente la activación. Oxidación del mPEG Se activa el grupo ácido con N-hidroxisuccinimda. Prof. J.M. Sánchez Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

8 Otra característica interesante de esta metodología: SE OBTIENEN DERIVADOS SOLUBLES EN CIERTOS DISOLVENTES ORGÁNICOS: Benceno, tolueno y clorados (cloroformo, 1,1,1-tricloroetano, tricloroetileno) LA CATÁLISIS SE HACE HOMOGÉNEA. Inmovilización en disolventes orgánicos? Siempre que se pueda recuperar el derivado. Recuperación: Añadiendo disolv. muy apolares (hexano, éter de petróleo) se produce la pptación. Prof. J.M. Sánchez Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

9 INMOVILIZACIÓN POR ENTRECRUZAMIENTO (CROSSLINKING) Prof. J.M. Sánchez Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

10 REACTIVOS ENTRECRUZANTES DIFUNCIONALES Prof. J.M. Sánchez Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

11 Cross-Linked Enzyme Crystals Cross-Linked Enzyme Aggregates Crosslinked Spray-Dried Enzymes Cross-Linked Enzymes Prof. J.M. Sánchez Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

12 Cross Linked Enzymes (CLE) A comienzos de los años 60 se describe por primera vez que el tratamiento de enzimas con reactivos difuncionales (fundamentalmente glutaraldehído) originaba derivados insolubles con retención de actividad (CLEs) Al mismo tiempo, se aumentaba la termoestabilidad (sobre todo en enzimas multiméricas), pero se necesitan unas condiciones muy delicadas (cantidad crosslinker, T, pH, fuerza iónica). El material obtenido era gelatinoso, y se intentó el entrecruzamiento con otras moléculas para aumentar propiedades mecánicas, Prof. J.M. Sánchez Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

13 Centro activo Enzima nativa Enzima desplegada (desnaturalizada) Enzima estabilizada por un entrecruzamiento intramolecular ENTRECRUZAMIENTO INTRAMOLECULAR Prof. J.M. Sánchez Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

14 Cross Linked Enzyme Crystals (CLECs) Prof. J.M. Sánchez Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

15 Proceso de cristalización Prof. J.M. Sánchez Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

16 Entrecruzamientos más habituales Prof. J.M. Sánchez Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

17 Ventajas 1.Mayor actividad por unidad de volúmen (partículas uniformes, microporosas, formadas por sólo moléculas de enzima pura, lo que implica la máxima posible concentración de enzima) 2.Gran actividad específica 3.Fácil separación del medio de reacción, lo que facilita su reutilización. 4.Buenas propiedades mecánicas y termoestabilidad, así como resistencia a disolventes orgánicos. 5.No producen contaminación medioambiental. 6.No requieren soportes muy caros 7.Resistentes a la proteolisis Desventajas 1.Dificultad de cristalización 2.Problemas de difusión (debe miminizarse el tamaño del cristal) 3.Alto precio Prof. J.M. Sánchez Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

18 Prof. J.M. Sánchez Montero, Facultad de Farmacia, UCM, Madrid, España CLECS

19 Prof. J.M. Sánchez Montero, Facultad de Farmacia, UCM, Madrid, España CLECS

20 Prof. J.M. Sánchez Montero, Facultad de Farmacia, UCM, Madrid, España Cross Linked Enzyme Agreggates (CLEAs)

21 Prof. J.M. Sánchez Montero, Facultad de Farmacia, UCM, Madrid, España POSIBILIDADESCLECs Enzimas puras y cristalinas Necesidad de enzima pura Estabilización de proteinas multiméricasCLEAs Enzimas con trazas de impurezas Coagregación de enzimas Agregación de enzima y polímero Estabilización de enzimas multiméricas Crosslinked Enzyme Crystals Crosslinked Enzyme Aggregates

22 Prof. J.M. Sánchez Montero, Facultad de Farmacia, UCM, Madrid, España CLEAs ESQUEMA DE CLEAs entrecruzante +precipitantePEG Sales, disolventes

23 Prof. J.M. Sánchez Montero, Facultad de Farmacia, UCM, Madrid, España

24 rápido lento Muy lento Enzima multimérica Enzima disociada (reversible) Enzima desnaturalizada (irreversible) Enzima multimérica entrecruzada Enzima desnaturalizada entrecruzada (irreversible) ENTRECRUZAMIENTO INTERMOLECULAR

25 Prof. J.M. Sánchez Montero, Facultad de Farmacia, UCM, Madrid, España INMOVILIZACIÓN POR ADSORCIÓN Es el método más sencillo y antíguo (células de acetobacter adsorbidas sobre palos de madera para obtener vinagre por fermentación-1815) Se puede emplear tanto para células como para enzimas. Las fuerzas de unión son débiles: Van der Waals Interacciones iónicas Enlaces de hidrógeno. Se producen fácilmente desorciones debido a: variaciones concentración de sustrato. Cambios de pH cambios de T alteración de la fuerza iónica.

26 Prof. J.M. Sánchez Montero, Facultad de Farmacia, UCM, Madrid, España INMOVILIZACIÓN POR ADSORCIÓN Soportes típicos: carbón activo sílice, alúmina, titania,... Tierra de diatomeas (Celite) celulosa resinas sintéticas CPG (controlled pore glasses). La mayoría de las enzimas se unen mejor a soportes polares Las lipasas se unen mejor a superficies hidrofóbicas MÉTODO MUY RECOMENDADO PARA ENZIMAS EN DISOLVENTES ORGÁNICOS (NO DESORCIÓN)

27 Prof. J.M. Sánchez Montero, Facultad de Farmacia, UCM, Madrid, España INMOVILIZACIÓN POR ADSORCIÓN Unión iónica es bastante habitual. Se usan a nivel industrial resinas intercambiadoras : catiónicas carboximetilcelulosa amberlite IRA aniónicas dietilaminoetilcelulosa (DEAE-celulosas) resinas Sephadex Se precisa un exquisito control del pH de la inmovilización : Coherencia con la carga neta enzimática como consecuencia del pKa.

28 Prof. J.M. Sánchez Montero, Facultad de Farmacia, UCM, Madrid, España INMOVILIZACIÓN POR ADSORCIÓN Metodologías empleadas: métodos en batch ayuda de precipitación (ej acetona, isopropanol) métodos en columna plug flow lecho fluidizado REGLA DEL DIÁMETRO DE GIRO (spin diameter)

29 Prof. J.M. Sánchez Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

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