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Curso Espectrometría de masas, Electrospray Trampa Iónica y Maldi-Tof UNIVERSIDAD FRANCISCO DE VITORIA Alberto Jorge García Laboratorio de Proteómica Centro.

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1 Curso Espectrometría de masas, Electrospray Trampa Iónica y Maldi-Tof UNIVERSIDAD FRANCISCO DE VITORIA Alberto Jorge García Laboratorio de Proteómica Centro de Biología Molecular Severo Ochoa Universidad Autónoma de Madrid-CSIC

2 Oferta del Servicio de Proteómica www2.cbm.uam.es/proteomica Análisis mediante Espectrometría de Masas Identificación sistemática de proteínas presentes en las bases de datos a partir de geles La Síntesis de Péptidos es un servicio independiente

3 Proteoma Proteína Péptidos Fragmentos BASE DE DATOS BASE DE DATOS Identificación Proteína Identificación Péptido Proteómica:

4 Servicio de Proteómica Digestión manual en gel Análisis mediante MALDI-TOF: Obtención del mapa peptídico e identificación mediante huella peptídica (PMF) Análisis mediante LC-ESI-IT Buen mapa con mezcla de proteínas: Exclusión dinámica (DE), búsqueda en DB mediante TurboSequest Mapa pobre ó interés en uno ó varios péptidos determinados: Monitorización de iones sencillos (SIM), búsqueda en DB por Tsequest ó confirmación mediante predicción teórica de fragmentación

5 Requisitos para la preparación de geles Reactivos Manipulación –Frescos, alto grado de pureza. –Muy cuidadosa, queratinas, recipientes de vidrio –Precauciones en la preparación de la muestra Confección del gel –Lo más cercano posible a la entrega de la muestra –STD no preteñidos, no coloreados, no recombinantes. En cantidades conocidas y MW conocidos –No admitimos bandas ó spot recortados. Gel completo

6 Requisitos para la preparación de geles Diseño del gel (monodimensional). Usuario –Minimizar el tamaño del carril para mejorar la razón proteína:gel –Optimizar la resolución y enriquecer para muestras muy complejas Geles 2 D (bidimensionales) –Incluido en la oferta de Servicio –Es crítica la preparación de la muestra por parte del usuario (Precipitación con acetona)

7 Tinción de geles Tinción Coomassie –Coomassie 0.2%/metanol 50%/10%acético. Fresco –Coomassie Coloidal, mayor contraste –No fijar con etanol, se forma acetato de etilo –Sensibilidad: 0.1 g, Cuantitativo –Prácticamente nunca interfiere con la digestión Tinción con plata (no recomendada) –Sensibilidad: 1-10 ng, No es cuantitativa –Alta variedad en los protocolos de tinción –Interfiere con la digestión –Aumenta la necesidad de concentración de proteína, bajo rendimiento y alto nivel de contaminantes

8 Tinción de geles Tinción fluorescente (mono ó 2 D) –Sensibilidad: Igual ó mayor a la plata –Variedad de tinciones (SYPRO Ruby, SYPRO Orange, SYPRO Red, Deep Purple…) –No interfiere con la digestión –La fluorescencia se puede medir en el Typhoon y recortar las bandas en un transiluminador UV (300 nm) –Disponible en el Servicio

9 Digestión in situ de geles Procedimiento adaptado de Mann y cols. Con variaciones entre coomassie y plata. Control interno de cada gel digiriendo std de pm (descarta problemas atribuibles a la preparación/tinción del gel) Control externo con bandas/spots de geles ya procesados (descarta problemas atribuibles al proceso de digestión y preparación de muestra para MS)

10 Servicio de Proteómica Digestión manual en gel Análisis mediante MALDI-TOF: Obtención del mapa peptídico e identificación mediante huella peptídica (PMF) Análisis mediante LC-ESI-IT Buen mapa con mezcla de proteínas: Exclusión dinámica (DE), búsqueda en DB mediante TurboSequest Mapa pobre ó interés en uno ó varios péptidos determinados: Monitorización de iones sencillos (SIM), búsqueda en DB por Tsequest ó confirmación mediante predicción teórica de fragmentación

11 Espectro de masas MALDI-TOF

12 Resultados búsqueda en Mascot

13 Asignación de péptidos en el mapa de MALDI

14 Aspecto de un mapa cuando no hay digestión Las masas provienen de queratinas y autoproteolisis de tripsina

15 Mapa típico de digestión de queratinas Contaminación por queratinas dentro del gel

16 Sypro Rubi vs Plata STD PM Gel plataGel Sypro después de cortar Picomoles

17 Sypro Rubi vs Plata STD 45 kDa 2 picomoles (88 ng) Sypro Plata Péptidos de Ovalbúmina T T T 17 péptidos 8 péptidos

18 Sypro Rubi vs Plata STD 45 kDa 500 fmoles (22ng) Sypro Plata T M T T T T T ? Péptidos de Ovalbúmina 10 péptidos 2 péptidos

19 Sypro Rubi vs Plata STD 45 kDa 250 fmoles (11 ng) Sypro Plata T T M T Péptidos de Ovalbúmina T M T T 11 péptidos 3 péptidos

20 Identificación mediante PMF Tres niveles de preparación de muestras: –Sensibilidad normal: método estándar en placa de acero inoxidable (automatizable) –Alta sensibilidad: método anchorchip con matriz HCCA y cristalización homogénea de Bruker (automatizable) –Muy alta sensibilidad: método anchorchip con matriz DHB y cristalización heterogénea (no automatizable) Siempre trabajamos con este método

21 Identificación mediante PMF Métodos de calibración: –Externa próxima, para búsquedas en DB con ppm. Los espectros se adquieren con esta calibración –Mediante zonas prohibidas (*) para búsquedas con ppm. Se aplica a la lista de masas obtenida por calibración externa –Interna de forma manual, mediante macro ó software (*) para búsquedas con ppm Motores de búsqueda: –Internet (Mascot, Profound) * Campillo, Martín and Vázquez

22 Identificación mediante PMF Causas por las que no se identifica una proteína Mapa con un nº insuficiente de péptidos Mezcla de proteínas Proteína no presente en DB Alto nivel de contaminación Modo en el que se genera la lista de masas

23 Servicio de Proteómica Digestión manual en gel Análisis mediante MALDI-TOF: Obtención del mapa peptídico e identificación mediante huella peptídica (PMF) Análisis mediante LC-ESI-IT Buen mapa con mezcla de proteínas: Exclusión dinámica (DE), búsqueda en DB mediante TurboSequest Mapa pobre ó interés en uno ó varios péptidos determinados: Monitorización de iones sencillos (SIM), búsqueda en DB por Tsequest ó confirmación mediante predicción teórica de fragmentación

24 Identificación de péptidos presentes en DB mediante LC- MS/MS ESI-IT Alta sensibilidad en modo full scan: Exclusión dinámica (DE), 100 fmoles para un digerido en solución de estándar de BSA Muy alta sensibilidad en modo SIM: Monitorización de iones sencillos, 1-10 fmoles para estándar de BSA

25 Exclusión Dinámica (Triple-play)

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27 m/z Intensidad Relativa A Secuenciación de especies individuales en mezclas de péptidos

28 Análisis mediante Espectrometría de Masas Análisis empleando MALDI-TOF –Muestras preparadas por usuario (incluye portas y matriz) –Muestras preparadas por el Servicio Análisis empleando LC-ESI-IT de fracciones de péptidos provenientes de HPLC preparadas por usuario

29 Equipos disponibles Un espectrómetro de masas tipo MALDI-TOF, modelo Autoflex de Bruker, equipado con reflector Un espectrómetro de masas de trampa iónica modelo LCQ Classic de Thermo Finnigan, equipado con sistemas de ionización de nanospray y microspray de fabricación propia, acoplado a una HPLC Agilent 1100 con restrictor de flujo inteligente (cedido en mayo 04 por un año) Interface metal needle kit para el acoplamiento LC- ESI-IT y columna RP de 180 m, flujos de 1,5 a 2 l/m

30 Procedimiento de trabajo Recepción y control de muestras –Aviso previo a la entrega de geles –Escaneo del gel, –Confección de ficha de usuario, –Instrucciones del trabajo a realizar Análisis –Digestión manual en gel –Obtención del mapa peptídico mediante MALDI- TOF –Análisis mediante LC-ESI-IT

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32 Personal del Servicio de Proteómica Rosana Rogado: –Laboral contratado temporal (CSIC), Ayudante de Investigación y Laboratorio Alberto Jorge: – Laboral fijo (CSIC), Técnico de Investigación y Laboratorio Yolanda Núñez: –Funcionaria. Técnico Especialista de Grado Medio Anabel Marina: –Laboral interino (CSIC), Titulado Técnico nivel 2


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