Métodos de observación de los microorganismos

Presentación del tema: "Métodos de observación de los microorganismos"— Transcripción de la presentación:

1 Métodos de observación de los microorganismos
Microbiología Práctica 2014

2 Introducción El ojo humano no puede enfocar partículas con un diámetro aproximado de 0,1 mm situado a menos 25 cm de distancia. La mayoría de los microorganismos son demasiado pequeños y no pueden ser detectados por el ojo humano; por lo tanto para su observación es necesario utilizar el microscopio

3 La observación microscópica puede efectuarse mediante el examen en fresco de una suspensión microbiana, lo que permite visualizar microorganismos vivos y reconocer sus movimientos, apreciar sus distintas formas, tamaños y agrupaciones

4 O bien mediante un extendido o frotis coloreado, lo que posibilita, según la técnica utilizada, diferenciar microorganismos, observar su morfología, tamaño agrupación o la observación de ciertos elementos no habituales, como flagelos, cápsula o endoesporas.

5 Las coloraciones fluorescentes tienen afinidad especial por ciertas estructuras de las células microbianas, que al ser tratadas con distintos fluorocromos y observadas al microscopio de fluorescencia se ven elementos brillantes sobre un fondo oscuro

6 Técnicas de microscopía
Se pueden utilizar diversas técnicas en el examen microscópico directo de la muestra clínica para demostrar la presencia de microorganismos o para observar ciertas características bioquímicas, fisiológicas o serológicas. Como el índice de refracción de las bacterias y de otros microorganismos es similar al medio del montaje, éstos no son visibles cuando se examina con luz brillante. En consecuencia, se puede necesitar cierta manipulación de la fuente de luz.

7 A menudo, es de gran ayuda reducir la cantidad de luz que ingresa al campo a través del cierre del diafragma, lo cual aumenta el contraste entre el objeto que se está observando y el fondo.

8 Preparación en fresco El examen en fresco de una suspensión microbiana se usa para examinar muestras clínicas sin colorear, lo que evita los artefactos que se pueden ocasionar en la fijación y en la coloración. Esta técnica permite observar microorganismos vivos y ciertas funciones fisiológicas, como la movilidad, así como apreciar sus distintas formas, tamaños y agrupaciones. Se utiliza principalmente para la visualización de bacterias, hongos unicelulares, protozoos y helmintos.

9 Preparación con solución fisiológica
Se utiliza Cloruro de sodio al 0,85% acuoso, portaobjetos, cubreobjetos y mezcla de parafina-vaselina. Propósito : para determinar la actividad biológica de los microorganismos, como movilidad y reacciones a ciertos químicos o reactividad serológica contra sueros específicos.

10 Técnica Tomar una gota de la muestra con el asa bacteriológica y depositarla en un porta objeto Colocar vaselina sólida o parafina en los bordes de un cubreobjeto para disminuir el secado del preparado, que se ve favorecido por el tiempo y el calor del foco luminoso. Cubrir la gota con el cubreobjeto. Para evitar que se formen burbujas debe depositarse primero en una arista y luego en el resto de él. Observar por medio del microscopio óptico compuesto, de contraste de fase o de campo oscuro

11 Esta técnica puede ser utilizada en microbiología bucal para el recuento de microorganismos móviles/inmóviles, lo que se utilizó para establecer el estado de salud o el grado de enfermedad periodontal del paciente. En algunas ocasiones resulta de utilidad colocar previamente en el portaobjeto una gota de azul de metileno o de tinta china y homogeneizarla con la muestra. Esta variante facilita la observación microscópica.

12 Ventaja: la rapidez Desventaja: falta de contraste y requiere de un observador entrenado para diferenciar el movimiento bacteriano propio de cada organismo, del movimiento browniano y del desplazamiento del preparado por la corriente del lìquido.

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14 Otras técnicas para el análisis directo de muestras no teñidas
Gota gruesa: sirve para el mismo propósito, excepto que existe menor distorsión debida la peso del cubreobjetos y puede lograrse un campo de foco más profundo dentro de la gota. Se utiliza por lo general para el estudio de la movilidad bacteriana

15 Preparación con yodo: suele utilizarse en paralelo con la preparación de solución fisiológica cuando se examinan heces u otros materiales para la búsqueda de parásitos. Tiñe el núcleo y los orgánulos intracitoplasmáticos de manera que son fáciles de visualizar pero paraliza la movilidad.

16 Preparación con hidróxido de potasio: Se utiliza para ayudar en la detección de elementos fúngicos en materiales gruesos o mucosos o muestras que contengan material queratinoso, como piel, uñas pelo. El KOH disuelve el fondo de queratina y por lo tanto desenmascara los elementos fúngicos o los hace más evidentes

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18 Tinción negativa Este método de tinción utiliza colorantes neutros o ácidos ya que tienen poca afinidad por la célula bacteriana por lo tanto como no se absorben se colorea el fondo en el que están las bacterias pero la célula queda incolora y transparente, así pues las bacterias aparecen como pequeñas áreas iluminadas en un fondo oscuro. La tinción acídica con nigrosina, o neutral ( con tinta china) son las más usadas.

19 Se utilizan para el examen microscópico directo de las cápsulas de muchos microorganismos. Los gránulos finos dan un fondo semiopaco contra el cual las cápsulas claras son fáciles de visualizar. Esta técnica se utiliza sobre todo para la visualización de las grandes cápsulas de Cryptococcus neoformans

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21 Preparación de un extendido
Antes de efectuar una coloración es necesario realizar un extendido sobre la superficie de un portaobjeto, de modo que se obtenga una película delgada y uniforme. Técnica Se ubica sobre la mesada un portaobjetos limpio. Si el extendido se realiza a partir de un desarrollo microbiano obtenido en medio sólido (agar) o una muestra consistente, se coloca sobre el portaobjeto, con asa bacteriológica, jeringa o pipeta, una gota de agua destilada estéril.

22 3. Con el asa previamente esterilizada, se tomará una pequeña cantidad de la muestra a examinar. 4. Se coloca la muestra sobre el portaobjeto y se la homogeiniza con la gota de agua destilada estéril. 5. Se toma el portaobjeto entre el dedo pulgar y el indice, y se extiende la gota en sentido del eje mayor, sin llegar a ninguno de los 4 bordes, hasta obtener una película delgada y uniforme. 6. Se seca a temperatura ambiente o manteniéndolo a 40 cm de la llama del mechero 7. Se fija.

23 La fijación tiene como finalidad que las bacterias queden adheridas al vidrio de manera que en los sucesivos lavados realizados durante la coloración no se arrastren los gérmenes. Debe procurarse, además que éste proceso altere lo menos posible la morfología microbiana existen dos métodos 1. Físico o método de Koch (calor): consiste en realizar 3 pasajes lentos sobre la llama del mechero. Debe enfriarse entre los pases 2. Químico (alcohol): se basa en cubrir el extendido con alcohol metílico y dejarlo durante 5 minutos.

24 Preparación de un extendido

25 Tinciones directas Para visualizar bacterias de manera adecuada y demostrar los detalles finos de sus estructuras internas en general se requieren tinciones biológicas. Las tinciones consisten en preparaciones acuosas y orgánicas de colorantes o grupo de colorantes que proporcionan una variedad de colores a los microorganismos y a los tejidos vegetales y animales, u otras sustancias de importancia biológica

26 Soluciones colorantes
Los colorantes pueden utilizarse como tinciones directos de materiales biológicos, como indicadores de cambio de pH en los medios de cultivo, como indicadores de oxidación-reducción para demostrar las funciones fisiológicas de los microorganismos utilizando las técnicas denominadas supravitales. Casi todos los colorantes son derivados orgánicos. La estructura química básica de la mayoría es el anillo de benceno.

27 Los colorantes están compuestos, en general por dos o más anillos bencénicos conectados por enlaces químicos bien definidos (cromóforos) que se asocian con la producción de color. La mayoría de los colorantes utilizados en microbiología son derivados de la anilina. En términos generales se clasifican como ácidos o básicos. Los colorantes básicos tiñen estructuras ácidas como la cromatína del núcleo celular y los colorantes ácidos reaccionan con sustancias básicas, como las estructuras del citoplasma.

28 Colorantes ácidos Colorantes Básicos Eosina Violeta de Genciana Fucsina básica Rojo neutro Cristal violeta

29 Leucoderivados Todos los colorantes biológicos tienen alta afinidad por el hidrógeno. Cuando los sitios moleculares que pueden unir hidrógeno están ocupados, el colorante se halla en su estado reducido y es generalmente incoloro. La persistencia del color está dada por la presencia del aire, debido a que el oxígeno tiene más alta afinidad por el hidrógeno que la mayoría de los colorantes.

30 Clasificación de las técnicas de tinción biológica
Coloración simple: son las que se emplean un solo colorante, ácido o básico y tiñen todos los elementos de un mismo color. Los tintes más utilizados son: Azul de metileno Verde de malaquita Rojo fenol Verde Janus Violeta de genciana

31 Esta tinción se realiza a partir de un extendido previamente fijado con calor.
Ventaja: su sencillez, lo que permite observar en minutos las distintas morfologías, tamaños y agrupaciones bacterianas Desventajas consiste en que no es posible diferenciar si existen microorganismos de distinta composición química

32 Azul de metileno de Loeffler
Tinción simple y directa utilizada para una variedad de microorganismos, se utiliza específicamente para detectar bacterias en frotis de LCR en casos de sospecha de meningitis bacteriana

33 Azul de toluidina Un colorante muy relacionado con el azur a y el azur de metileno, se utiliza para teñir improntas de biopsia de pulmón y frotis de secreciones respiratorias para la detección de Pneumocystis jiroveci en forma rápida

34 Azul de lactofenol Colorante fuertemente ácido que actualmente se utiliza para la tinción directa de micelios fúngicos y estructuras de fructificación.

35 Tinciones diferenciales
Esta tinción utiliza dos colorantes en forma sucesiva; las más empleadas en bacteriología son la coloración de Gram y la de Ziehl-Neelsen. En estas coloraciones se usan 4 componentes: Colorante primario o principal colorea a los microorganismos cargados negativamente por tratarse de un colorante básico Mordiente: determina que el colorante primario actúe con mayor intensidad y logra que se fije más íntimamente a los gérmenes. Pueden ser químicos como sales metálicas, solución yodada o lugol, tanino, fenol, o físicos como el calor.

36 El agente decolorante es un solvente orgánico como el alcohol, alcohol acetona o ácidos.
El colorante secundario o colorante de contraste es un tinte básico, cuyo color contrasta con el colorante primario.

37 Coloración de Gram La coloración de Gram, es la más utilizada en el laboratorio microbiológico para la observación de especímenes, facilita la observación microscópica y permite diferenciar dos grandes grupos de Bacterias Grampositivas gramnegativas

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39 Fundamento La afinidad grampositiva o gramnegativa de las bacterias depende de la composición y estructura química de la pared celular. Al observar el preparado con el microscopio, después de realizar los primeros 4 pasos, Todas las bacterias se ven de color violeta. 1. cubrir la superficie del preparado con cristal violeta o violeta de genciana y dejar en contacto 1 minuto. 2. Lavar con abundante agua 3. Cubrir con lugol durante 1 minuto 4. lavar con abundante agua

40 5. Inclinar el porta objeto y dejar gotear alcohol-acetona hasta que el preparado deje de perder color. 6. Lavar con abundante agua 7. Cubrir el preparado con safranina o fuscina basica durante 1 minuto. 8. Lavar con abundante agua 9. Dejar secar 10. Observar al microscopio en lente de inmersión Luego de aplicar el decolorante algunas bacterias conservan el color mientras otras se decoloran.

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42 Las que mantienen el color violeta son grampositivas y las que lo pierden se llaman gramnegativas. Esto se debe a que el alcohol acetona (decolorante) desorganiza la membrana externa de las gramnegativas y permite la salida del colorante primario.

43 Ventajas: método rápido y sencillo, permite observar la forma, tamaño y agrupación de los microorganismos, permite diferenciar las grampositivas de las gramnegativas, permite saber si la flora es mixta o monoespecífica, proporciona orientación terapéutica y posibilita la conservación de preparados Desventajas: no todas las bacterias pueden tomar la coloración, tiñe débilmente bacterias sin pared

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46 Tinciones ácido-resistentes
Se utilizan al menos, tres tinciones acidorresistentes diferentes, cada una de las cuales se basa en la retención por algunos microorganismos de una tinción primaria incluso al ser expuestos a fuertes agentes decolorantes, como mezclas de ácidos y alcoholes

47 Coloración de Ziehl-Neelsen
Se utiliza para diagnosticar bacterias del género Mycobacterium y algunas especies de Nocardia, Corynebacterium y Actinomycetes. Las diferencias fundamentales con la coloración de gram radican en que el colorante primario Fuscina se halla asociado a un mordiente químico ácido fénico o carbólico, al que se le aplica un mordiente físico calor, y la decoloración se realiza mediante la combinación de dos solventes orgánicos, como el ácido y el alcohol

48 Técnica Cubrir el preparado con carbolfucsina Pasar un hisopo encendido por debajo del portaobjeto hasta llegar a la emisión de vapores durante 5 minutos. Lavar con abundante agua Inclinar el portaobjeto y dejar caer gota a gota el ácido alcohol hasta que el preparado deje de perder color Cubrir con azul de metileno por un minuto Lavar con agua Dejar secar el preparado Observar con la lente de inmersión

49 Fundamento La coloración de Ziehl-Neelsen pone de manifiesto la capacidad que tienen algunas bacterias de resistir la decoloración por ácidos y alcohol. Esta propiedad se debe al alto contenido de lipidos complejos (ácidos micólicos) y ceras que poseen algunos microorganismos en su pared celular Los gérmenes que resisten la decoloración se denominan bacterias ácido-alcohol resistentes BAAR y se ven de color rojo en los extendidos coloreados , mientras que las bacterias no BAAR se ven de color azul

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51 Coloración de Kinyoun Es similar a la de Ziehl-Neelsen pero con tres diferencias básicas: No se calienta el colorante principal El ácido para decolorar es más débil No se decolora con alcohol

52 Otras técnicas de Coloración
Giemsa: es utilizado en microbiología para la diferenciación intracelular y extracelular de parásitos en sangre circulante, para la observación de formas levaduriformes e inclusiones virales. Tinción de esporas: como las endoesporas poseen varias envolturas, que las hacen impermeables. Para lograr teñirlas debe recurrirse a métodos especiales de coloración que utilizan calor. Uno de los métodos utiliza verde de malaquita que tiñe las esporas de verde u safranina que tiñe las formas vegetativas

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54 Tinción de flagelos: se realiza cubriendo el extendido con una suspensión coloidal inestable de sáles de ácido tánico que precipita sobre las estructuras aumentando su tamaño y luego se cubre con fucsina ácida. Tinción de Fontana-Tribondeau: impregnación argéntica que es una precipitación de sales de plata, que se depositan en las estructuras celulares lo que aumenta su espesor y permite ver los microorganismos de un color pardo oscuro sobre un campo claro, para formas espiraladas de bacterias

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56 Coloraciones fluorescentes
La fluorescencia es la propiedad que tienen algunos colorantes denominados fluorocromos de ser excitados cuando absorben luz uv. Naranja de acridina: se utiliza para el estudio de microorganismos en hemocultivos y LCR. Rodamina-auramina: posee afinidad por los ácidos micólicos de la pared celular de las micobacterias Blanco de calcofúor: posee afinidad por la celulosa y la quitina de la pared de los hongos

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58 Coloraciones vitales Son montajes de materia viva teñida. El objetivo de estas tinciones consiste en facilitar la observación de la morfología y la estructura bacteriana. Se utilizan colorantes en bajas concentraciones como azul de metileno, rojo neutro, verde Janus y naranja de acridina

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