Validación Parte 4: Validación relacionada con el CC

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1 Validación Parte 4: Validación relacionada con el CC
Módulos Complementarios de la Capacitación sobre Buenas Prácticas de Manufactura Validación Parte 4: Validación relacionada con el CC Módulo 1, Parte 4 se enfoca en la Validación relacionada con el Control de Calidad. El tiempo sugerido para la Parte 4 es: minutos. (Nota para el instructor: los tiempos señalados son aproximados.)

2 Validación Introducción ¿Por qué es necesario un monitoreo analítico?
¿Cuál es el propósito de la validación analítica? Introducción: El monitoreo analítico de un producto farmacéutico, o de ingredientes específicos dentro del producto, es necesario para garantizar su inocuidad y eficacia a través de todas las fases de su vida de estantería, incluyendo almacenamiento, distribución y uso. Este monitoreo debería realizarse de acuerdo con las especificaciones validadas durante el desarrollo del producto. El propósito principal de la validación analítica es garantizar que un procedimiento análitico seleccionado de resultados reproducibles y confiables que son adecuados para el propósito intentado. Es necesario definir en forma apropiada tanto las condiciones en las cuales el procedimiento va a ser usado como el propósito para el cual es intentado. Estos principios se aplican a todos los procedimientos descritos en un farmacopea o no descritos en una farmacopea usados por la empresa fabricante. Estas pautas se aplican a los procedimientos usados para examinar atributos químicos y fisicoquímicos, pero muchos son igualmente aplicables a procedimientos biológicos y microbiológicos.

3 Validación Objetivos Introducir los conceptos de :
Desarrollo del protocolo Calificación de instrumento Procedimiento analítico Extensión de la validación Transferencia de métodos Validación de ensayos químicos, físicos, biológicos y microbiológicos Los objetivos de la Parte 4, Módulo 1 son introducir los conceptos de la validación analítica: Desarrollo del protocolo Calificación de instrumento Procedimiento analítico Extensión de la validación Transferencia de métodos y Validación de ensayos químicos, físicos, biológicos y microbiológicos

4 Validación La validación de procedimientos analíticos requiere:
Instrumentos calificados y calibrados Métodos documentados Patrones de referencia confiables Analistas calificados Integridad de la muestra La validación de los procedimientos analíticos requiere: Instrumentos calificados y calibrados; la calificación es idéntica a la que se discutió previamente para los equipos de producción. Métodos documentados: el ensayo debe estar documentado por el mismo laboratorio y no solo una fotocopia del método, tales como métodos de farmacopea, los cuales no explican los detalles exactos. Patrones de referencia confiables: estos deberían ser preferiblemente patrones de referencia primarios provenientes de la comisión de farmacopea o de un Laboratorio de Control Nacional, o patrones secundarios que han sido calificados contra material de referencia primario y han sido completamente caracterizados. Analistas calificados: la experiencia y calificaciones tal como se detallaron en un módulo previo dentro de los Módulos de Capacitación Básica sobre BPM, sobre Personal (Módulo 8). Deberían haber en el informe de validación referencias cruzadas de la capacitación y registros de la competencia en la realización de los ensayos. Integridad de la muestra: la muestra debe ser irreprochable -ver también la diapositiva de la validación del ensayo microbiológico.

5 Validación Protocolo de validación para método analítico
Declaración de propósito y alcance Responsabilidades Método de ensayo documentado Lista de materiales y equipos Procedimiento para los experimentos para cada parámetro Análisis estadístico Criterio de aceptación para cada parámetro de desempeño Protocolo de validación para el método analítico: El protocolo de validación para un método analítico es muy similar al que se requiere para cualquier proceso de validación. Debería incluir: La declaración del propósito y del alcance Las responsabilidades para la aprobación, ejecución y revisión El método de ensayo documentado el cual debería tener un número de referencia único La lista de materiales y equipos: los instrumentos, reactivos, estuches de ensayo y así sucesivamente El procedimiento detallado de los experimentos para cada parámetro de desempeño Análisis estadístico. Estos son usualmente desviación estándar, regresión lineal y Análisis de Varianza o ANOVA. Los criterios de aceptación para cada parámetro de desempeño los cuales deberían ser establecidos antes que comience la fase experimental del trabajo.

6 Validación Calificación del instrumento
Marca, modelo y manual del fabricante Modificaciones Calificación de la instalación y de la operación Programas de calibración Cronogramas de mantenimiento Calificación de los Instrumentos: Los instrumentos críticos del laboratorio de CC tienen requerimientos de calificación similares a los de los equipos utilizados en la fábrica. Debería disponerse de: La marca, modelo y manual del fabricante. Cualquier modificación que se le haya hecho al instrumento desde que se compró Esto es muy importante porque el servicio del instrumento podría implicar actualizaciones, por Ej. de software, que no son reveladas por la persona de servicio al supervisor de GC. La calificación de la instalación y de la operación. Los programas de calibración. Cronogramas de mantenimiento.

7 Validación Características de los procedimientos analíticos(1)
Exactitud Precisión Repetibilidad Reproducibilidad Características de los procedimientos analíticos: Exactitud La exactitud del procedimiento es la cercanía de los resultados obtenidos por el procedimiento al verdadero valor. La exactitud del procedimiento puede determinarse aplicando el procedimiento a muestras del material a ser examinado que han sido preparadas con exactitud cuantitativa. Cuando sea posible, estas muestras deberían contener todos los componentes del material incluyendo la sustancia a analizar (analito) Posiblemente tres métodos: 1. Añadir un testigo a la matriz de placebo: el componente activo es añadido (“como testigo”) en cantidades conocidas usualmente en un rango desde 25 a 150 % de la potencia de la dosis; 2. Técnica de añadido del patrón; y 3. Comparación de los dos métodos para equivalencia. Precisión La precisión del procedimiento es el grado de concordancia entre los resultados de los ensayos individuales. Ésta es medida por la dispersión de los resultados individuales desde la media y es usualmente expresado como la desviación estándar o como el coeficiente de variación .  (La relación entre Exactitud y Precisión es mostrada en la próxima diapositiva.) Repetibilidad (Variación dentro del laboratorio) Ésta es la precisión del procedimiento cuando es repetido por el mismo analista bajo las mismas condiciones establecidas (mismos reactivos, equipos, local y laboratorio) y dentro de un intervalo corto de tiempo.   Reproducibilidad Ésta es la precisión del procedimiento cuando es realizado bajo condiciones diferentes —usualmente en laboratorios diferentes—sobre muestras separadas putativamente idénticas tomadas del mismo lote homogéneo de material.  

8 Relación entre exactitud y precisión
inexacto e impreciso inexacto pero preciso Exacto pero Validación Relación entre exactitud y precisión Exacto y preciso La relación entre exactitud y precisión puede representarse por flechas disparadas a un blanco. En el primer blanco pequeño de arriba muestra las flechas que han caído indiscriminadamente. Esto no es ni exacto ni preciso. En el segundo blanco de la izquierda están bastante bien agrupadas pero no están en la diana. Esto es preciso pero inexacto. Esto es a veces denominado como una desviación analítica y a veces se puede aplicar un factor de corrección. En el tercer blanco pequeño se muestra que las flechas PROMEDIO están sobre la diana, pero la precisión es inaceptable. El cuarto, el blanco grande muestra que todas las flechas están agrupadas y sobre la diana; éste muestra exactitud y precisión.

9 Validación Características de los procedimientos analíticos (2)
Fortaleza Robustez Variabilidad causada por : Variaciones de día a día De analista a analista De laboratorio a laboratorio De instrumento a instrumento De columna cromatográfica a columna cromatográfica De estuche de reactivos a estuche de reactivos Inestabilidad de los reactivos analíticos Características de los procedimientos analíticos: (Cont.) Fortaleza y Robustez La fortaleza y la robustez, de procedimientos analíticos son unas medidas de su capacidad para permanecer no afectado por pequeñas, pero intencionadas variaciones en parámetros del método, y proporcionando así una indicación de la confiabilidad del método durante su uso normal, bajo varias condiciones. La fortaleza es debida a factores externos al método; la robustez es debida a factores internos al método. Las cosas que pueden causar variabilidad incluyen variaciones : De día a día en p. Ej. temperatura, humedad relativa, etc. De analista a analista De laboratorio a laboratorio De instrumento a instrumento De columna cromatográfica a columna cromatográfica De estuche de reactivos a estuche de reactivos Tiempo de preparación de la muestra a ensayo Inestabilidad de los reactivos analíticos

10 Validación Características de los procedimientos analíticos (3)
Linealidad y rango Especificidad Sensibilidad Límite de detección Límite de cuantificación Características de los procedimientos analíticos:(Cont.) Linearidad y rango La linealidad de un procedimiento analítico es su capacidad para producir resultados que sean directamente proporcionales a la concentración del analito en las muestras. El rango del procedimiento es una expresión de los niveles más bajos y más altos de analito que se han demostrado son determinables con un precisión, exactitud, y linealidad aceptables. Especificidad La especificidad o selectividad de un procedimiento es su capacidad para medir el analito en una manera que esté libre de interferencia de otros componentes en la muestra que está siendo analizada (por ejemplo, impurezas que provienen de la fabricación u otros ingredientes diferentes al analito). Sensibilidad La sensibilidad es la capacidad del procedimiento de ensayo para registrar pequeñas desviaciones en concentración. Esto es la pendiente de la curva de calibración. Debería evitarse un uso más general del término para englobar al límite de detección y al límite de cuantificación. Límite de detección El límite de detección es el más bajo nivel de analito que puede ser detectado, pero no necesariamente determinado en una forma cuantitativa. Límite de cuantificación El límite de cuantificación es la más baja concentración de analito en una muestra que puede ser determinada con una exactitud y precisión aceptable cuando se aplica el procedimiento requerido.

11 Material de referencia mg/mL
Validación Tabla de valores (x,y) x y  # Material de referencia mg/mL Calculado mg/mL 1 0.0100 0.0101 2 0.0150 0.0145 3 0.0200 0.0210 4 0.0250 0.0260 5 0.0300 0.0294 6 0.0400 0.0410 Éste es un gráfico típico de data bruta para verificar rango y linealidad. La tabla de data bruta a la mano derecha se ha graficado usando regresión lineal para obtener la línea que mejor se ajusta. El eje de las x es el material patrón que se pesó y el eje de las y es el valor calculado a partir de las lecturas del instrumento. Estas son graficadas (la línea azul con los puntos como una caja amarilla y las barras de error) y se realiza un análisis de regresión lineal. Las dos líneas amarillas son los límites de confianza de 95% de ambos lados.

12 Validación Estadística de linealidad Intercepto -0.0002
Límite de Linealidad y Rango – mg/mL Pendiente Coeficiente de correlación Pearson Olkin y Pratt Desviación estándar relativa del procedimiento 3.4% Determinación de la linealidad: Los datos del gráfico de la diapositiva anterior son analizados para obtener: El valor del intercepto Es importante no forzar a la línea a través del cero ya que el intercepto xy debería conocerse para poder verificar la pendiente también. Determinación del Límite de Linealidad y Rango El ensayo debería ser usado únicamente dentro del rango y linealidad validados. El rango de trabajo si la pendiente es lineal debería ser de 75% a 125% del contenido estimado del analito. Pendiente “La pendiente” verifica la capacidad de medir exactamente pequeños incrementos del analito. Este método muestra una relación casi de uno a uno. Coeficiente de Correlación (r2) El coeficiente de correlación es calculado. Se requiere mejor que 0.99 pero mejor que debería obtenerse rutinariamente por ejemplo, en caso de ensayos de HPLC. Desviación estándar Debería calcularse la desviación estándar. Ésta generalmente debería ser menor del 2%. Sin embargo, en algunos métodos manuales, tales como métodos volumétricos puede ser tan alta como el 3%. Aunque la linealidad es aceptable, el valor de 3.4% es insatisfactorio y podría dar resultados arbitrariamente altos o bajos resultando en una posible liberación de material con potencia inferior o superior, o rechazo de material aceptable.

13 Validación LdeC, LdeD y RSR Límite de Cuantificación
Límite de Detección Relación de Señal a Ruido Pico B LdC Pico A LdD No hay criterios específicos establecidos para el Límite de Cuantificación (LdeC) y para el Límite of Detección (LdeD) pero hay recomendaciones disponibles de especificaciones y farmacopeas. El ruido se mide haciendo funcionar el instrumento a la máxima ganancia sin procesar ninguna muestra. La onda generada es ruido debido a la electrónica del instrumento, etc. El pico es medido en relación a este ruido y se calcula la relación. Esto se conoce como la relación de señal a ruido (RSR). Generalmente: El Lde D RSR debería ser mayor de 2:1. El pico A es aceptable para LdeD pero no para cuantificación; El LdeD puede calcularse si la desviación estándar (DE) de la respuesta (la cual es la desviación estándar del blanco) y la pendiente es determinada: LdeD = 3.3 x DE pendiente Similarmente el LdeC = 10 x DE EL LdeC RSR debería ser generalmente por encima de 10:1. El pico B es adecuado para cuantificación; La Precisión como un porcentaje de la desviación estándar relativa debería ser de % al límite para el LdeC. ruido Línea basal

14 Validación Diferentes clases de ensayos analíticos
Clase A: Para establecer identidad Clase B: Para detectar y cuantificar impurezas Clase C: Para determinar cuantitativamente la concentración Clase D: Para evaluar las características ¿Qué características analíticas son aplicables en casos particulares? No todas las características discutidas previamente necesitarán considerarse en todos los casos de validación; aquellas aplicables deben ser identificadas en base a un estudio de caso por caso. Sin embargo, como una guía, pueden ayudar las generalizaciones siguientes. Los métodos utilizados para el análisis de materiales farmacéuticos pueden ser clasificados a groso modo de la manera siguiente: • Clase A: Ensayos diseñados para establecer la identidad, ya sea de las sustancias drogas a granel o de un ingrediente particular en una forma de dosificación terminada. • Clase B: Los métodos diseñados para detectar y cuantificar impurezas en una sustancia droga a granel o en una forma de dosificación terminada. La detección de impurezas, sin cuantificación es referida como un ensayo de límite. • Clase C: Métodos usados para determinar cuantitativamente la concentración de una sustancia droga a granel o un ingrediente importante en una forma de dosificación terminada; referido con un ensayo. • Clase D: Métodos usados para evaluar las características de formas de dosificación terminadas tales como perfiles de disolución y uniformidad de contenido.

15 Validación Característica A B cuant. B Ensayo C D Exactitud X X*
Validación Característica A B cuant. B Ensayo límite C D Exactitud X X* Precisión Robustez Linealidad y rango Especificidad Límite de detección Límite de cuantificación Esta tabla ofrece recomendaciones a las características que son relevantes en cada caso. Habrán ocasiones en las que claramente ciertas características señaladas como no requeridas pueden ser necesarias y viceversa. El propósito por el cual se hace el ensayo puede tener una relación con la selección de características y la extensión a la cual ellas son especificadas. Por ejemplo, aunque las Clases B, C, y D son todas referidas en la Tabla 1 como que requieren consideración de precisión, el rigor aplicado puede ser diferente. Para la estimación de una impureza puede no ser necesario ser tan preciso como para la evaluación cuantitativa de una sustancia droga a granel. De igual manera, se puede aceptar un grado de desviación en determinar la exactitud de un ensayo para uniformidad de contenido (clase D) que no sería permisible para una evaluación cuantitativa de la concentración de un ingrediente en una forma de dosificación terminada (clase C). Similarmente, una prueba diseñada para establecer la identidad de una nueva droga, para la cual no se dispone de datos previos, puede necesitar considerablemente más investigación que para ensayos destinados a verificar la identidad de sustancias drogas establecidas por largo tiempo para ser incluidas en una farmacopea.. Se podría requerir un énfasis diferente para fines de farmacopeas en oposición a propósitos de registros. Por ejemplo la robustez es una característica crítica para una metodología de farmacopea pero puede ser menos significativa para una especificación de liberación del fabricante. Lecturas sugeridas: WHO Expert Committee on Specifications for Pharmaceutical Preparations. Thirty-second Report. Geneva, World Health Organization, 1992 (WHO Technical Report Series No. 823). Annex 5: Validación of analytical procedures used in the examination of pharmaceutical materials. ICH Harmonised Tripartite Guidelines. Text on Validación of analytical procedures y Validation of analytical procedures: Methodology. October and November 1996 respectively. * Se puede permitir un grado de desviación

16 Validación Extensión de la validación
Métodos nuevos requieren validación completa Métodos de Farmacopea requieren validación parcial (o verificación) Cambios significativos implican revalidación parcial cambios de equipo cambios de fórmula cambios de proveedores de reactivos críticos Extensión de la Validación requerida: Métodos nuevos (del fabricante/literatura) requieren validación completa. Métodos que estén en farmacopeas requieren validación parcial, si el método no ha sido validado previamente para ese producto farmacéutico específico. Los fabricantes deberían validar los métodos de farmacopea para asegurar que ellos funcionan con sus propios productos - con una exactitud y especificidad mínima. La monografía de la USP establece: “Ensayos generales y pruebas ya establecidas -deberían ser validados para verificar su exactitud (y ausencia de interferencias posibles) cuando se usen para un nuevo producto o materias primas.” Al menos una revalidación parcial se requiere siempre que se hagan cambios significativos de los cuales podrían razonablemente esperarse que afectarán los resultados obtenidos, por Ej. en caso de cambio de instrumentos, cambio en la fórmula del producto, cambio de proveedores de reactivos críticos, cambio de método.

17 Validación Transferencia de métodos analíticos
Protocolo y procedimiento del método de transferencia precisión exactitud ruggedness Método científico escrito y aprobado Verificación de la competencia Aceptación formal por el nuevo laboratorio Transferencia de métodos analíticos: Puede ser necesario transferir un método analítico desde, digamos el laboratorio de Investigación y Desarrollo, al laboratorio de CC. Esto debería: requerir evidencia documentada de la transferencia del método requerir un protocolo y procedimiento de la transferencia del método El protocolo debería estar dirigido a los parámetros de desempeño: - precisión - exactitud - fortaleza Antes de que el método sea transferido debe tenerse escrita y aprobada la documentación. Competencia: El método debe seguirse en el nuevo laboratorio sin aporte (o asesoría - ya que cualquier capacitación debe haberse hecho con anterioridad) del laboratorio del que proviene. Deben haber tres ensayos en el nuevo laboratorio que sean comparables con los resultados del laboratorio de donde proviene. Luego se requiere la aceptación formal de la gerencia del nuevo laboratorio.

18 Validación Requerimientos de validación del laboratorio de química (1)
Balanzas Cromatografía HPLC, HPTLC, GC, TLC Aparato de disolución o desintegración Determinación de humedad Karl Fischer Aparatos de punto de fusión, de ablandamiento o de congelación Hornos, refrigeradoras, incubadoras Requerimientos de validación del laboratorio de química: (Nota para el instructor: El Instructor debería discutir los requerimientos de CD de los instrumentos del laboratorio, incluyendo la calibración. ¿Cuándo debería hacerse? y ¿cómo ? La lista de abajo debería ser verificada en el laboratorio y la lista de requerimientos debería ser usada por el instructor para estimular la discusión.) Balanza: CI y CO , linealidad, rango, precisión, exactitud. Cromatografía: HPLC, HPTLC, GC, TLC: CI y CO más - por ej. la bomba para el reparto de solvente – tensión, presión, fugas; precisión del inyector de reparto de la muestra; verificación del detector (por ej. UV variable, Índice de Refracción (IR) o arreglo del diodo); y validación de la computadora. Aparato de disolución o desintegración: CI, CO y calibración. Validación de la computadora si es relevante. Karl Fischer: CI, CO. Validación de la computadora si es relevante. . Aparatos de punto de fusión, ablandamiento o congelación: CI, CO. Verificar contra calibradores, validación de la computadora si es relevante. Horns, refrigeradores, incubadores, calderas: CI, CO, tiempo de calentamiento, enfriamiento, mapeo térmico. Los registradores de datos podrían necesitar validación de la computadora.

19 Validación Requerimientos de validación del laboratorio de química (2)
pH metro Polarímetro - rotación óptica Refractómetro Espectrofotómetro UV/Vis, IR, FTIR, Raman, AA Temporizadores Viscosímetro Equipo volumétrico Requerimientos de validación del laboratorio de química: (Cont.) (Nota para el instructor: La lista de abajo debería ser verificada en el laboratorio y la los requerimientos de abajo deberían ser usados por el instructor para estimular la discusión.) pH metro: CI, CO, linealidad, estabilidad, pendiente, temperatura. Polarímetro: Rotación óptica- CI, CO y calibración contra discos de cuarzo o de sacarosa, validación de la computadora si es requerida. Refractómetro: CI, CO. Estabilidad de la Temperatura, baño del agua CI y CO si es relevante, precisión y exactitud. Espectrofotómetro: UV/Vis, IR, FTIR, Raman, Absorción atómica (AA): CI, CO y calibración. Validación de la computadora si es requerida. Temporizadores: CI, CO y calibración contra el Estándar Nacional de Tiempo. Viscosímetro: CI, CO y calibración. Equipo volumétrico: Autotituladores, equipo de titulación no acuosa: CI, CO y linealidad, precisión, exactitud. Validación de la computadora si es requerida. Material de vidrio volumétrico: pipetas, buretas, fiolas volumétricas: CI.

20 Validación Validación típica de un ensayo de HPLC (1)
Competencia del sistema (verificación del desempeño) precisión del sistema eficiencia de la columna factor de simetría factor de capacidad Las pruebas de competencia del sistema se realizan durante la fase de validación del método. Estas pruebas fueron diseñadas para evaluar el desempeño del sistema completo, previas a la validación del método. Esto se hace analizando una muestra para “competencia del sistema” , la cual consta de los componentes principales incluyendo impurezas. Ésta puede contener también excipientes, que pudieran interferir con los picos de interés. La competencia del sistema es evaluada en términos de los parámetros siguientes: - precisión del sistema - eficiencia de la columna (usualmente >2000) - factor de simetría (criterio de aceptación 0.9 a 2.5) - factor de capacidad (criterio de aceptación NLT 1.5)

21 Validación Validación típica de un ensayo de HPLC (2)
Validación del método especificidad exactitud precisión linealidad robustez Desúes de la prueba de adecuabilidad del sistema, se valida el método analítico real verificando: Especificidad: verificando que el método está libre de interferencias provenientes de excipientes, impurezas, etc. Exactitud: verificando que el método da resultados muy cercanos a los resultados verdaderos. Precisión: verificando que el método es preciso. Linealidad: verificando que el método producirá resultados que son directamente proporcionales a la concentración de analito en las muestras. Robustez: verificando que el método soportará cambios deliberados.

22 Validación Ensayos biológicos Pueden ser difíciles de "validar"
"Validez" en base a caso por caso Cumplir estrictamente las monografías de los Ensayos biológicos en las farmacopeas Ensayos biológicos: Validación de método biológicos : Ejemplos de estos son los ensayos de pirógenos en conejos. Los principios y parámetros de desempeño para validación de métodos enumerados en la monografía general en la varias farmacopeas pueden ser aplicados a los ensayos en sistemas biológicos. Sin embargo, puede ser difícil "validar" un ensayo biológico usando las características descritas previamente. Los sistemas biológicos contienen una mayor variabilidad que un sistema químico o físico. No es realista aplicar el mismo criterio de aceptación a sistemas biológicos ya que no es posible definir totalmente todos los factores claves que pueden afectar los ensayos ni hablar de controlarlos. La validación es todavía un asunto crítico con los sistemas biológicos. Consecuentemente, debe haber un buen diseño del ensayo, la eliminación de un sesgo sistemático y una validez intrínseca: La validez es evaluada en una modalidad de caso por caso. El diseño debe incluir lo siguiente: EL ensayo se realiza por triplicado; El ensayo incluye tres diluciones diferentes de la preparación patrón y tres diluciones de las preparaciones de la muestra de actividad similar a la de la preparación patrón; El diseño del ensayo es aleatorizado; idealmente el analista debe ser “enceguecido” a la ubicación de la muestra en la matriz; Si la muestra de ensayo se presenta en suero o está formulada con otros componentes, el patrón debería prepararse de la misma manera. Por último, las monografías de ensayos biológicos deben ser cumplidas estrictamente sin permitir desviaciones.

23 Ensayos microbiológicos que requieren validación
Ensayos de límites microbianos Recuento microbiano Ensayo de esterilidad Ensayo de eficacia de preservativo Programa de control de ambiente Ensayos biológicos Los métodos microbiológicos también necesitan validación. En cada laboratorio de ensayos microbiológicos, los tipos de métodos que deben ser verificados o validados incluyen: Ensayos de límites microbianos - tales como los ensayos de límites de microorganismos indicadores, nominados en las farmacopeas, (BP/EP y USP cepas específicas de Escherichia coli, Staphylococcus aurens, Pseudomonas aeruginosa y Salmonella typhimurium). Recuento microbiano - tal como un recuento total de aerobios viables de materias primas y de productos terminados. Ensayos de esterilidad Ensayos de efectividad de preservativos Programa de control ambiental - tales como monitoreo de agua, aire y superficies Ensayos biológicos - tales como los ensayos para vitaminas y antibióticos en placas grandes.

24 Validación Validación de procedimientos de ensayo microbiológicos (1)
Es virtualmente imposible validar completamente los procedimientos de ensayo para cada microorganismo Neutralizar/inactivar o diluir las sustancias inhibidoras Enfrentamiento periódico de los medios CC de los medios Métodos confiables Validación de procedimientos de ensayos microbiológicos: De acuerdo a algunas personas es virtualmente imposible validar completamente los procedimientos de ensayo para cada microorganismo que podría ser objetable, sin embargo, los métodos son validados generalmente para la recuperación de “microorganismos indicadores” específicos propuestos por las farmacopeas y los que generalmente se requiere estén ausentes del producto. La validación del método demuestra que cualquier sustancia inhibitoria presente en la muestra ha sido neutralizada/inactivada o diluida a niveles por debajo del nivel inhibidor. Involucra la inoculación de medios de cultivo con niveles bajos de microorganismos inhibidores específicos, en presencia y en ausencia del material a ser ensayado. La capacidad de los medios para promover el crecimiento de los microorganismos puede afectarse por el proceso de preparación del medio, por los procesos de esterilización y de almacenamiento. La edad de los medios de cultivo puede afectar sus propiedades de promoción del crecimiento y de selectividad. Por esta razón, la vida de estantería de los medios de cultivo debería ser validada y los medios no deben usarse más allá de su fecha de vencimiento. Todos los lotes de medios de cultivo preparados deben ser sometidos a CC para garantizar que los medios son adecuados para sus fines propuestos. Los métodos que el fabricante seleccione deben poder detectar confiablemente la presencia de microorganismos objetables tales con especies de Pseudomonas, hongos, Escherichia coli, etc.

25 Validación Validación procedimientos de ensayos microbiológicos (2)
Temperatura y tiempo de incubación Todos los microorganismos no pueden crecer en los medios Variaciones en los medios puede afectar la recuperación Desinfectantes o preservativos inhibidores Muestra procedimientos manejo, almacenamiento, transporte Validación de procedimientos de ensayos microbiológicos: (Cont.) Los parámetros y razones siguientes para validar los métodos microbiológicos incluyen los siguientes hechos: La temperatura y el tiempo de incubación pueden no permitir el crecimiento de todos los microorganismos. Un ejemplo clásico es demostrado por el agua donde la flora natural crece mejor a temperaturas por debajo de 30oC, y por un período mayor que el que se le da normalmente a otras muestras - hasta mayor de 5 días. Los medios podrían no permitir el crecimiento de todos los microorganismos. El uso del agar soya caseína para el análisis de agua podría subestimar la microflora hasta 3 logs dependiendo del tiempo y la temperatura comparada digamos con el R2A o el Agar para Recuento en Placas (Plate Count Agar). Las variaciones en los medios puede afectar la recuperación. Por ejemplo, la recogida de un producto conteniendo pseudomonas fue necesaria cuando se usaron medios más allá de su vida de estantería para buscar microorganismos objetables. Los desinfectantes o preservativos pueden inhibir el crecimiento. Al agua con cloro (aún a niveles bajos) se le debería añadir tiosulfato de sodio al recipiente de la muestra para neutralizar inmediatamente al cloro libre. Los procedimientos de muestreo, manejo y transporte de las muestras pueden afectar los resultados. Si la muestra es contaminada cuando se toma, o si se almacenan por tiempo largo, o si se usan temperaturas de almacenamiento muy calientes o muy frías, entonces la muestra se afectará. Si el laboratorio está muy lejos de donde se toma la muestra puede ser necesario demostrar la cadena de frío.

26 Validación Validación del método microbiológico de recuento de viables (1) Métodos incorporación en placa / diseminación en placa filtración por membrana Número más probable Tamaño de la muestra Dilución de ensayo Tamaño del inóculo Validación del método de recuento de viables: Métodos usados comúnmente - Método de incorporación o diseminación en placas de la dilución óptima. Las diluciones permitidas para determinar el óptimo son 1:10 pero generalmente no más de 1:100. - Método de filtración por membrana – es el preferido para productos filtrables. - El número más probable – NMP, es generalmente el método de recuento microbiano menos exacto. sin embargo, para ciertos productos con cargas microbianas muy bajas donde la filtración por membrana no es una opción, éste puede ser el método más apropiado. Tamaño de la muestra y diluciones El tamaño de la muestra debería ser del orden de 10g o 10mL aunque 1 – 5 g pueden usarse para lotes más pequeños. La solución para el ensayo y las diluciones debe ser especificada. El uso dentro de un cierto período máximo desde su preparación debe ser parte de la Validación. Microorganismos de enfrentamiento para la validación Usar los microorganismos de un colección de cultivos tipo recomendada por las farmacopeas. Staphylococcus aureus Bacillus subtilis Escherichia coli Candida albicans Aspergillus niger Inóculo de enfrentamiento 10 –100 ufc totales inoculadas en de 0.1ml a 100mL de la solución de ensayo. Los microorganismos deben ser enfrentados por separado y no mezclados en un ensayo.

27 Validación Validación del método microbiológico de recuento de viables (2) Condiciones de la filtración por membrana Condiciones de incubación Criterios de aceptación Validación del método de recuento de viables: (Cont.) Condiciones de la filtración por membrana (FM) El filtro debe ser estéril con un borde hidrofóbico si están presentes sustancias con agentes antimicrobianos. El tamaño promedio del poro debería ser micrómetros no de 0.2 micrómetros debido a que las de 0.2 causan efectos inhibidores denominados paradoja del diámetro del poro. Las soluciones son mucho más lentas de filtrar a través de un filtro de 0. 2 micrómetros y pueden causar problemas si se filtran líquidos viscosos. El número de lavados debe ser validado especialmente para soluciones con sustancias inhibidoras presentes. Condiciones de incubación Durante la validación del método, la evidencia visible de crecimiento debe serlo dentro de las 48 horas después de la incubación a 30°-35°C. La evidencia visible de los microorganismos de ensayo fúngicos debe serlo dentro de los 3-5 días después de la incubación a 20°-25°C. Durante la realización del ensayo real de recuento de viables aeróbicos, las condiciones de incubación deberían ser generalmente 30°-35°C por 5 días y 20°-25°C por 5 días, para el recuento de hongos. Criterio de aceptación Recuperación comparada con un control positivo. Para validación satisfactoria del método de recuento de viables aeróbicos totales las BP/EP requieren que la recuperación del microorganismo de enfrentamiento difiera de los recuentos del control en un factor no mayor de 5, la USP requiere una tasa de recuperación de al menos 70%.

28 Validación Requerimientos de la validación de ensayos de esterilidad
pH, promoción del crecimiento y esterilidad de los medios Validación del producto Ensayo de la estásis Control ambiental Controles negativos Microorganismos de enfrentamiento Requerimientos de validación de los ensayos de esterilidad: El ensayo de esterilidad oficial debe ser validado contra cada producto ya que sustancias inhibidoras, presentes, aún en muy bajos niveles, pueden impedir el crecimiento del contaminante dentro del tiempo prescrito. Los requerimientos de la validación de los ensayos de esterilidad incluyen: Los medios deben ser competentes antes de usarlos. Esto es cada lote de medio esterilizado debe ser ensayado para la promoción del crecimiento (ensayo de fertilidad), esterilidad y pH. Validación del producto; añadiendo un nivel bajo de los microorganismos de ensayo y demostrar una clara evidencia de crecimiento dentro de los 3 días para las bacterias y de 5 días para los hongos. “El ensayo de la estásis” al final del período de incubación para demostrar que el medio de cultivo permite el crecimiento por el período completo. Destacar que éste no es un requisito obligatorio sino que es recomendado como parte de las Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL). El monitoreo ambiental del ambiente de los ensayos de esterilidad debe ser satisfactorio, deben realizarse pruebas de sedimentación en placas y de los operarios. Se requieren controles negativos para demostrar que el analista tiene la destreza necesaria para realizar las manipulaciones del ensayo adecuadamente. Usualmente el control negativo es un producto doblemente esterilizado pero su elección debería reflejar también las manipulaciones requeridas para la muestra de ensayo. Los controles negativos se realizan usualmente antes y después de la sesión de ensayo. Los microorganismos de enfrentamiento son: Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Aspergillus niger, Clostridium sporogenes, y Candida albicans. Para cada microorganismo de enfrentamiento, el nivel del inóculo es de CFU. Los ensayos de validación usando microorganismos vivos no deberían ser realizados en el área de los ensayos de esterilidad.