Estudio de estructura nativa de proteínas

Presentación del tema: "Estudio de estructura nativa de proteínas"— Transcripción de la presentación:

1 Estudio de estructura nativa de proteínas
Biofisicoquímica Estudio de estructura nativa de proteínas Dr. Eduardo Prieto Dr. Ariel Alvarez Instituto de Ciencias de la Salud Universidad Nacional Arturo Jauretche Av. Lope de Vega 106, Florencio Varela – Buenos Aires – Argentina

2 Estructura de proteínas

3 ¿Cuáles son las posibles conformaciones de una proteína?
El estado nativo es metaestable. El estado conformacional predominante está en equilibrio con los otros estados. N Ia Ib In U Degradación  [Urea]  [Urea] Agg Ic Nativo (N) Desplegado (U o D) Parcialmente plegado (MG, I) Cuerpos de inclusión (expresión in vivo en E. coli)

4 N U Hipótesis termodinámica del plegado proteico
La conformación nativa es la más estable La proteína adquiere esta conformación como resultado de restricciones conformacionales impuestas por la cadena principal y por otras características físicas y químicas de los aminoácidos Anfinsen desplegó a la RNasa bajo condiciones extremas y observó que la estructura de la enzima SE REPLIEGA ESPONTÁNEAMENTE en ausencia de otros factores biológicos externos. N U

5 En 1972 mientras recibe el Nobel
"The native conformation is determined by the totality of interatomic interactions and hence by the amino acid sequence, in a given environment." N C C N

6 La secuencia de las proteínas o alguna propiedad relacionada con la secuencia determina la estructura 3D MTEMKDDFAKLEEQFDAKLGIFALDTGTNRTVAYRPDERFAFASTIKALTVGVLLQQKSIEDLNQRITYTRDDLVNYNPITEKHVDTGMTLKELADASLRYSDNAAQNLILKQIGGPESLKKELRKIGDEVTNPERFEPELNEVNPGETQDTSTARALVTSLRAFALEDKLPSEKRELLIDWMKRNTTGDALIRAGVPDGWEVADKTGAASYGTRNDIAIIWPPKGDPVVLAVLSSRDKKDAKYDDKLIAEATKVVMKALNMNGDKLPSE ?

7 La secuencia de las proteínas o alguna propiedad relacionada con la secuencia determina la estructura 3D MTEMKDDFAKLEEQFDAKLGIFALDTGTNRTVAYRPDERFAFASTIKALTVGVLLQQKSIEDLNQRITYTRDDLVNYNPITEKHVDTGMTLKELADASLRYSDNAAQNLILKQIGGPESLKKELRKIGDEVTNPERFEPELNEVNPGETQDTSTARALVTSLRAFALEDKLPSEKRELLIDWMKRNTTGDALIRAGVPDGWEVADKTGAASYGTRNDIAIIWPPKGDPVVLAVLSSRDKKDAKYDDKLIAEATKVVMKALNMNGDKLPSE -lactamasa

8 Caracteristicas del Estado nativo (N)
Compactación óptima Grupos polares en el exterior Mínima superficie expuesta Actividad biológica Interacciones terciarias fijas Resistente a la acción de proteasas

9 Arg244 4 Ser70 3 Ala273 4 1 Ser130 Glu166  loop Lys73 5 Asn132
Ala237: posicionamiento de grupo carbonilo del anillo ‑lactámico. Asn132, Arg244: interacción con sustrato. Glu166: Activación de ser70 para ataque nucleofílico. Ser70: ataque nuclofílico al grupo carbonilo del anillo ‑lactámico. Lys73 y Ser130: participan en la formación del intermediario acil‑enzima. Lys73 Arg244 Glu166 Ala273 Ser70 Asn132 Ser130 4 3  loop 1 4 5 El sitio activo de la -lactamasa es una exquisita sonda conformacional, involucra residuos distantes en secuencia y que adquieren su ubicación espacial con el correcto plegado 3D.

10 Interacciones del solvente con la estructura nativa
Human Aldose reductase at 0.66 Å E. Howard

11 Características del Estado desplegado (U)
Máxima expansión (aumenta el radio hidrodinámico promedio) Exposición al solvente máxima de las cadenas laterales. Máxima superficie expuesta En teoría infinitas conformaciones (random coil) Clusters apolares fluctuantes en teoría sin interacciones preferenciales Alta sensibilidad a proteasas

12 Expansión

13 Características de los Estados parcialmente plegados (MG, I)
Grupo heterogéneo de conformaciones no nativas Estructura residual secundaria, nativa o no nativa Sin estructura terciaria rígida Topología variable Tendencia a la agregación Sensibilidad a proteólisis

14 Las contribuciones entrópicas
La diferencia enorme entre el número de conformaciones permitidas a U y N El ordenamiento de las moléculas de agua sobre la superficie accesible La expulsión de moléculas de agua en el plegado

15 Las contribuciones entalpicas
Las interacciones intramoleculares Las interacciones con el solvente Las interacciones entre moléculas del solvente.

16 N U Entropía conformacional Entropía del solvente
Entalpía de solvatación Entalpía del solvente N U La diferencia enorme entre el número de conformaciones permitidas a U y N El ordenamiento de las moléculas de agua sobre la superficie accesible Interacciones de van der Waals Puentes de hidrógeno Puentes salinos

17 Cinética del plegado proteico

18 Escala de tiempo Side-chain rotations Loop closure Protein aggregation
Protein folding Helix formation Folding of b--hairpins

19 Cyrus Levinthal ( ) demostró mediante algunos cálculos que si la búsqueda de la conformación plegada fuera al azar cada molécula debería atravesar por un número astronómico de conformaciones desde el estado desplegado. La búsqueda le tomaría tanto tiempo a la cadena polipeptídica que haría del plegado un proceso muy poco probable  Cada aminoácido posee dos posibles conformaciones  El polipéptido (100 residuos) entonces posee 2100 posibles conformaciones. Damos 1 picosegundo para cada transición entre estados conformacionales, El tiempo requerido para el proceso de plegado sería de 1018 segundos o 1010 años.

20 Anfinsen (experimentos con la ribonucleasa)
Paradoja de Levinthal Sin embargo las proteínas en condiciones adecuadas se pliegan rápida, espontáneamente y en forma reversible. N U Anfinsen (experimentos con la ribonucleasa)

21 Coordenada de reacción
El plegado es un proceso espontáneo. Energía Coordenada de reacción TS U N Depende solo de la estructura primaria de la proteína y de las interacciones con el solvente.

22 ¿Como se puede desplazar el equilibrio?
Osmolitos Caotropos ● Sulfato de sodio ● TMAO ● Urea ● Cloruro de guanidinio ● Tiocianato de guanidinio

23 Energía Estado desplegado Estado nativo [D]

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27 ¿Como hacemos para determinar la cantidad de proteína nativa?

28 Desplegado en el equilibrio
= [U] k u [N] k f K NU G NU = - RTln K NU k u N U k f [GdmHCl] Cm [GdmHCl] (M) [GdmHCl] (M) m

29 k u N U k f [D] = Cm

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33 ¿Como nos damos cuenta de equilibrios intermedios?
Estructura secundaria: CD en el UV lejano Estructura terciaria: CD en el UV cercano, fluorescencia, actividad enzimática Compactación: SEC-FPLC, DLS (RS)

34 Estados parcialmente plegados en equilibrio con la forma nativa

35 El plegado es un proceso espontáneo.

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37 Modelos de plegado: Nucleación

38 Modelos de plegado: Difusión, colisión y coalescencia

39 Modelos de plegado: El modelo jerárquico

40 Modelos de plegado: El modelo del rompecabezas.

41 Modelos de plegado: El colapso hidrofóbico

42 Embudos conformacionales y paisajes energéticos.

43 Cinética de plegado

44 Energía A B

45 Replegado 6 M GdmCl → 0.05 M GdmCl
50.05 M GdmCl, 20 C Actividad -lactamasa t1/2(ES‑LC9) = 408 min t1/2(ES‑L) = 1.2 min SEC-FPLC t1/2(ES‑LC9) = min

46 Dos proteínas con el mismo fold. Una dos estados y otra tres estados?
Lisozima -lactalbumina