Aragón, Carolina; Sobisch, Leonardo; Zambrano, Karen. Estudios Interdiciplinarios de la Enfermendad de Chagas. Año 2012. UNSL – FQByF.

Presentación del tema: "Aragón, Carolina; Sobisch, Leonardo; Zambrano, Karen. Estudios Interdiciplinarios de la Enfermendad de Chagas. Año 2012. UNSL – FQByF."— Transcripción de la presentación:

1 Aragón, Carolina; Sobisch, Leonardo; Zambrano, Karen. Estudios Interdiciplinarios de la Enfermendad de Chagas. Año 2012. UNSL – FQByF.

2  El presente estudio fue realizado en Chile.  Las regiones rurales y periurbanas de la III y IV región son hiperendémicas.  Se estima que hay 150000 individuos afectados.(2005)

3  En la imagen se muestran las regiones del país de Chile  Regiones Hiperendémicas ( III y IV)

4  En Chile existen 3 vectores: -Triatoma infestans - Mepraia spinolai (autoctono de Chile) - Mepraia gajardoi  La transmisión vertical es el mecanismo mas importante.

5  Se orienta a la pesquisa la detección de Ac específicos mediantes técnicas serológicas convencionales( ELISA, IFI) métodos de alta sensibilidad y especificidad.  Para el diagnostico parasitológico, las herramientas mas utilizadas son: - Xenodiagnóstico XD - Reacción en cadena de la polimerasa PCR

6  Se utiliza para el diagnostico y en el seguimiento de individuos tratados.  Acelera la detección del parasito en pacientes de fase crónica.  Es una herramienta complementaria al XD, dada la capacidad del mismo de amplificar a T. cruzi al actuar como medio de cultivo biológico.

7  Evaluar el diagnostico parasitológico en pacientes chagásicos crónicos mediante PCR en sangre periférica y deyecciones de Triatominos alimentados mediante XD en pacientes chagácicos crónicos, según técnicas de extracción y purificación del DNA.

8  POBLACION: 50 pacientes en fase crónica de la IV región de Chile. Se determina infección por T. cruzi mediante: -IFI: con un titulo igual o superior a 1/20. -ELISA: con D.O mayor o igual a 0,20.  OBTECIÓN MUESTRA DE SANGRE: 2ml de sangre venosa con igual volumen de sc guanidina-HCl 6M y EDTA 0,2M.  Se incuba la sangre a 98 °C durante 15 min.

9  XENODIAGNÓSTICO: esto se realiza de forma paralela a la toma de muestra de sangre.  Se preparó pool con las deyecciones obtenidas de cada período de incubación para la reacción de PCR-XD.  SE OBUVIERON DOS GRUPOS: 1. 25 personas XD (+) 2. 25 personas XD (-)

10  Extracción con fenol-cloroformo (Caso 1).  Extracción con fenol-cloroformo y purificación con Sephadex (Caso 2).  Extracción y purificación con solución de CHOMEZYNSKI con fenol (Caso 3).  Extracción y purificación con el Kit comercial Jetquick Blood DNA purification (Caso 4).

11  Purificación con Sephadex G 25 (Caso 5).  Extracción y purificación con la solución de CHOMEZYNSKI con fenol (Caso 6).  Purificación con el Kit comercial Jetquick Blood DNA purification (Caso 7). Verificación y presencia de DNA por espectofotometría.

12  Mix PCR 1. Primers Oligonucleótidos Kinetoplastídicos 121 y 122: 3 µl (10 µM) 2. Buffer Taq Polimerasa: 4 ml 3. MgCl 2 : 2 µl (2mM) 4. 4 desoxiNTP: 0.4 µl (10mM) 5. Taq Polimerasa: 0.2 µl (1U) 6. H 2 O destilada: 2.4 µl

13  Desnaturalización a 98°C durante 1 min.  Hibridación 64°C por 1 min.  Extención a 72°C por 2 min. Se realizaron 33 ciclos intermediarios. 10 µl del amplificado se sometieron a ELECTROFORÉSIS.

14

15 1. Caso 1: XD (-) evidencia que existen niveles indetectables de parásitos en el 96% de los casos. XD (+) el 76 % de los casos no se detectan T. cruzi mediante PCR. 2. Caso 2: XD (-) aumenta el 16 % de la detección de T. cruzi en las muestras. XD (+) no hay variaciones en el rendimiento.

16  Caso 3: XD (+) tuvo mejor rendimiento en un 24 % con respecto a los dos métodos anteriores.  Caso 4: XD (-) es más eficaz, evidenciando parásitos en el 76 % de los casos. XD (+) evidencia parásitos en el 40% de los casos.

17  Caso 5: XD (+) el rendimiento fue bajo.  Caso 6: resultados similares al anterior.  Caso 7: XD (-) se detectó parásitos en el 84% de los casos. XD (+) detecta parásitos en el 96% de los casos.

18  En relación a las extracción, es mejor trabajar con el Kit comercial, ya que proporciona mayor especificidad tanto en muestras de sangre como en deyecciones.  En cuanto a la elección del tipo de muestra, es óptimo trabajar con deyecciones ya que el Triatoma infestans actúa como medio de cultivo biológico, además, el ADN obtenido es de mayor calidad.

19  Es crucial la cantidad de muestra a amplificar, debido a que contribuye a la optimización de la técnica.  En pacientes crónicos la parasitemia es baja y oscilante, en los casos negativos un factor a considerar puede ser el volumen de sangre tomado, y es por esto que la PCR es una herramienta eficaz en la detección de T. cruzi.

20