CAPÍTULO 2. MARCADORES DE DETERMINACIÓN INDIRECTA

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1 CAPÍTULO 2. MARCADORES DE DETERMINACIÓN INDIRECTA
Antígenos eritrocitarios Antígenos leucocitarios Proteínas plasmáticas y enzimas eritrocitarios Alotipos de las inmunoglobulinas (Grupos GM) Indice

2 Bibliografía complementaria
Buhler, S., Sanchez-Mazas, A., 2006, De l’Europe à l’Inde: structure génétique et diversité des populations de part et d’autre de leurs frontières géographiques et culturelles. Antropo, 11, Calderon R, Vidales C, Peña JA, Perez-Miranda A, Dugoujon JA 1998 Immunoglobulin allotypes (GM and KM) in Basques from Spain: Approach to the Origin of the Basque Population. Human Biology, 70: (JAP790) Cavalli-Sforza et al, 1988, Reconstruction of human evolution: Bringing together genetic, archaeological, and linguistic data. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: (JAP545) Dugoujon JM, Hazout S, Loirat F, Mourrieras B, Crouau-Roy B, Sanchez-Mazas A 2004 GM Haplotype Diversity of 82 Populations Over the World Suggests a Centrifugal Model of Human Migrations American Journal of Physical Anthropology 125:175–192 (JAP1112) García-Fernández et al, 1997, Genetic polymorphisms of HLA class I and class II system in the Basque population. Transplantation Proceedings, 29: (JAP1033) Giovannoni et al., 2006, Structure génétique de la population Corse. Antropo, 11, Mastana SS, Calderon R, Peña JA, Reddy PH, and Papiha SS 1998 Anthropology of the apolipoprotein E (apo E) gene: low frequency of apo E4 allele in Basques and in tribal (Baiga) populations of India. Annals of Human Biology, 25: (JAP1294) Nei M and Roychoudhury K 1993 Evolutionary Relationships of Human Populations on a Global Scale Mol Biol Evol 10: (JAP1293) Rebato E, Susanne C, Chiarelli B, Eds. (2005) Para comprender la Antropología Biológica. Estella (Navarra): El Verbo Divino Rosenberg NA, Mahajan S, Gonzalez-Quevedo C, Blum MGB, Nino-Rosales L, et al. (2006) Low levels of genetic divergence across geographically and linguistically diverse populations from India. PLoS Genet 2(12): e215 (JAP

3 Introducción Existen diferentes polimorfismos que resultan interesantes para estudiar el resultado de los procesos evolutivos en las poblaciones humanas. Veremos los más importantes, ordenados de acuerdo a un criterio histórico. Así, los primeros en ser analizados fueron los grupos sanguíneos, ya que fueron los primeros en ser descubiertos, a principios del siglo XX. Por el contrario, los polimorfismos que se analizan directamente sobre la molécula de ADN se han comenzado a estudiar más tardíamente, debido a las dificultades técnicas que entraña su análisis, cuestiones que no han sido solventadas hasta el último tercio del siglo XX. Se han dividido tradicionalmente los polimorfismos en dos grupos, uno que podemos denominar polimorfismos de determinación indirecta, que incluye aquellos caracteres detectables mediante el análisis de los productos derivados de los genes y otro denominado polimorfismos de ADN o de determinación directa, que incluye aquellos caracteres detectables mediante el análisis directo del material hereditario. Dentro de los polimorfismos de determinación indirecta se incluyen principalmente marcadores detectables en el tejido sanguíneo. La razón de que haya sido este tejido el seleccionado tradicionalmente para este tipo de análisis es obvia: es fácil de obtener, ya que mediante una simple punción la sangre fluye libremente y su obtención no es lesiva para el individuo. Por ello, se han podido analizar extensas muestras de muy diversas poblaciones una vez que se pusieron a punto las técnicas de análisis. Desde luego, aquellos polimorfismos que para su análisis necesitan de una biopsia de un determinado tejido, se han visto relegados a estudios minoritarios, ya que la disponibilidad de voluntarios para una prueba dolorosa siempre es menos entusiasta. Los diversos polimorfismos sanguíneos que se han analizado pueden clasificarse, de manera elemental, como sigue:

4 Antígenos eritrocitarios
Esquema de un antígeno eritrocitario Son los grupos sanguíneos, moléculas de glicoproteínas que se disponen superficialmente en la membrana de los glóbulos rojos. En general los genes responsables, es decir, aquellos genes que indirectamente se están analizando a través de estos caracteres, codifican para las enzimas glicosil-transferasas que añaden los monosacáridos terminales de las glicoproteínas. Se conocen unos treinta sistemas de antígenos eritrocitarios.

5 Antígenos eritrocitarios
Test directo Aglutinación Test indirecto Las técnicas utilizadas para su detección son, principalmente, la reacción directa de aglutinación y la aglutinación indirecta o test de Coombs, dependiendo de la capacidad del anticuerpo de unirse a varios eritrocitos o a uno solo. Si bien en la actualidad están prácticamente abandonados estos métodos, la base de datos que se reunió en su día fue muy amplia y permitió analizar un gran número de poblaciones de todo el mundo.

6 Antígenos eritrocitarios
Distribución de frecuencias del grupo sanguíneo ABO

7 Antígenos eritrocitarios
Distribución de frecuencias de los alelos FY*BA, FY*B y FY*BES del grupo sanguíneo Duffy. FY*BES es un alelo silente, que no codifica para ningún antígeno

8 Antígenos leucocitarios
El Complejo Mayor de Histocompatibilidad Son moléculas glicoproteicas que se pueden encontrar en la membrana de los glóbulos blancos, pero algunas también en casi todas las células del organismo. Los más importantes son los codificados por los genes HLA, responsables entre otros fenómenos, de la aceptación o rechazo de los tejidos u órganos injertados, de forma que el trasplante sólo es estable cuando existe identidad genética entre el individuo donante y el receptor.

9 Antígenos leucocitarios
Genes HLA clase I y clase II y sus correspondientes glicoproteínas Son 9 genes mayores y varios menores. Aunque su número es menor que el de los genes responsables de los antígenos eritrocitarios, presentan una variabilidad mucho mayor. Si es raro que un sistema eritrocitario tenga más de 4 alelos polimórficos actualmente se conocen más de 7200 alelos de los genes mayores HLA. La estructura de las moléculas de antígeno codificados por los diferentes genes varía en función de los dominios que las componen.

10 Antígenos leucocitarios
Función de las moléculas HLA clase I La función varía entre los genes clase I y clase II. En el primer caso, los antígenos que se reconocen son endógenos y en el segundo exógenos. Función de las moléculas HLA clase II

11 Antígenos leucocitarios
Entre las técnicas inmunológicas utilizadas tradicionalmente para su detección, la más habitual era la denominada técnica de citotoxicidad mediada por anticuerpos y complemento. Se basa, como en las reacciones de aglutinación, en la unión específica del antígeno con su correspondiente anticuerpo. Sin embargo, la unión del anticuerpo a los antígenos leucocitarios determina la lisis celular, es decir, la rotura de las membranas de los glóbulos blancos. Por ello, se reconoce una reacción positiva cuando mediante la observación al microscopio aparecen un gran número de células lisadas.

12 Antígenos leucocitarios
Buhler et al, 2006 En esta figura se muestra un análisis comparativo de frecuencias de alelos HLA entre poblaciones de Europa, Próximo y Medio Oriente.

13 Proteínas plasmáticas y enzima eritrocitarias
Esquema básico de un sistema de electroforesis Cátodo - Anodo + En el plasma sanguíneo y en los eritrocitos se encuentran disueltas una gran cantidad de proteínas con diferentes funciones, no siempre bien identificadas. Algunas proteínas presentan actividad enzimática (catalizando reacciones bioquímicas en el organismo). Se conocen más de veinte enzimas con carácter polimórfico en los eritrocitos. Casi todas las proteínas son identificables mediante electroforesis. Puede describirse la electroforesis como la migración de moléculas a través de un soporte o medio relativamente inerte bajo la influencia de un campo eléctrico y se basa en la propiedad que tienen las proteínas de adquirir carga eléctrica a determinados valores de pH.

14 Proteínas plasmáticas y enzima eritrocitarias
Electroforesis horizontal Mediante la variante más sencilla de electroforesis, las moléculas son sometidas a una diferencia de potencial eléctrico. Para ello se dispone de una fuente de alimentación, con la que se generan las condiciones más adecuadas de voltaje, amperaje y tiempo de exposición. Mediante dos electrodos se transmite la diferencia de potencial entre ambos extremos de una cubeta de electroforesis, en cuyo interior se encuentra un gel por el que se desplazarán las muestras y una solución tamponada que transmite en alguna medida la electricidad. Las moléculas se desplazarán en función de su carga eléctrica y de su peso molecular. Las diferentes variantes de una molécula se reconocen por su diferente recorrido a lo largo del gel.

15 Proteínas plasmáticas y enzima eritrocitarias
Cubeta de electroforesis de campo pulsante Electroforesis vertical Existen diferentes variantes de electroforesis, basadas en el peso molecular de las moléculas o en su punto isoeléctrico. Puede ser horizontal, submarina si el gel se encuentra sumergido en el tampón, vertical si las moléculas se desplazan desde arriba hacia abajo, etc.

16 Proteínas plasmáticas y enzima eritrocitarias
Nei and Roychoudhury, 1993 Dendrograma obtenido con 26 poblaciones analizadas para 28 marcadores: ABO, DI, FY, JK, K, MNS, P, RH, SE, ACPl, ADA, AKl, ESD, GLOl, G6PD, GPT, PGD, PGM 1, PGM2, GC, HP, PI, TF, HBB, GM, KM, HLA-A, HLA-B, and PTC.

17 Alotipos de las inmunoglobulinas (Grupos GM)
Esquema de una molécula de anticuerpo Hay un tipo de polimorfismo proteico que no es analizable mediante electroforesis y que dada su importancia para el estudio de la heterogeneidad de las poblaciones humanas, merece una consideración especial. Son los alotipos de las inmunoglobulinas, entre los que destacan los grupos GM. Se trata de unos polimorfismos que se revelan en las moléculas de las inmunoglobulinas (es decir, en los anticuerpos). La molécula de inmunoglobulina consta de una zona variable y una zona constante. La zona variable es la que se adapta a todo tipo de moléculas reconocidas como extrañas por el organismo (los antígenos) y toma por tanto una enorme variedad de configuraciones. En un mismo organismo habrá un gran número de moléculas de inmunoglobulinas diferenciables por su zona variable. La zona constante es igual en todas las inmunoglobulinas de un individuo y presenta unas pocas variantes en el conjunto de poblaciones humanas. Los grupos GM representan una pequeña parte de la zona constante de las cadenas pesadas y son codificados por 3 genes situados en el cromosoma 14 (14q 32.3).

18 Alotipos de las inmunoglobulinas (Grupos GM)
Africa Dugoujon et al., 2004 N. Africa Para su análisis se utilizaban, entre otras, técnicas de inhibición de la aglutinación. En esencia, si se encontraba presente el antígeno analizado, se unía a un anticuerpo específico, que quedaba capturado. Al añadir después unos eritrocitos también específicos, puesto que no quedaban anticuerpos, no se daba aglutinación. Si el suero del individuo no portaba el antígeno buscado, se daba aglutinación. Los haplotipos GM han resultado ser marcadores muy útiles, pues permiten diferenciar muy claramente las poblaciones humanas. En la figura se muestran las frecuencias haplotípicas en diferentes poblaciones de todo el mundo. Europa C. Asia America E. Asia Oceanía