Laboratorio de Referencia para EET de los Animales

Presentación del tema: "Laboratorio de Referencia para EET de los Animales"— Transcripción de la presentación:

1 Laboratorio de Referencia para EET de los Animales
Etiología y diagnóstico de las Encefalopatías Espongiformes Transmisibles de los animales Laboratorio de Referencia para EET de los Animales Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agrícolas - INTA Castelar “Cursos de capacitación y actualización para la prevención y vigilancia de EETs”

2 Origen de la EEB

3 Hipótesis sobre el origen
Scrapie Garrapatas, organoclorados???? Enfermedad espontánea???? Origen exótico???? Origen humano???? (Colchester & Colchester Lancet. 366, 856; 2005). Scrapie ?

4 PRNP Scrapie: enfermedad genética? Ovino: gen Sip sA/sA 150-200 días
sA/pA 300 días pA/pA PRNP 1936: Transmisión experimental de Scrapie

5 Agente etiológico

6 Características del agente de EET
-Hay cepas -Barrera de la especie -Tamaño similar a virus -No hay respuesta de anticuerpos -Resistencia (calor, radiaciones, nucleasas) -Sensibilidad parcial a proteasas -Ácido nucleico? (tiempo de incubación, lesiones SNC)

7 Modelo de agente de TSE Debe explicar
-Falta de respuesta de anticuerpos -Existencia de cepas (tiempo de incubación, lesiones) -Barrera de la especie (transmisión estocástica)

8 Inactivación del agente de EEB
Calor húmedo 121 ºC, 1 atm, 20 min Incompleta 133 ºC, 3 bar, 20 min Calor seco 138 ªC Incompleta Métodos químicos Hidróxido de Sodio 1N, 24 hs Hidróxido de Sodio 2N, 2 hs Hipoclorito de Sodio 12 hs

9 Agentes hipotéticos de "Scrapie"
Virus Lentos No convencionales "Virino“ Agentes no convencionales PRIONES Hipotéticos

10 SAF: Scrapie Associated Fibrils
Alper et al., BBRC 22: 278 (1966) Pattison & Jones, Vet Rec 80: 2 (1967) Griffith, Nature 215: 1043 (1967) Merz et al., Acta Neuropathol 54: 63 (1981) SAF: Scrapie Associated Fibrils

11 Priones “Pequeñas partículas proteináceas que resisten la inactivación por métodos que modifican ácidos nucleicos” PrP PrPC: proteína normal del huesped PrPSc: proteína patogénica de Scrapie Stanley B. Prusiner. Science 216: , 1982

12 Isoformas de PrP Normal PrPC (33-35 kD) Asociada a
Proteinasa K Detergente - Normal PrPC (33-35 kD) Asociada a enfermedad PrPSc (33-35 kD) PrP27-30 (27-30 kD) + - +

13 Isoformas PrPC y PrPSc PrP PrP Detergentes Proteasas  -hélice (%) 
soluble insoluble Proteasas sensible resistente (PrP27-30)  -hélice (%) 42 30 3 43  (%) hoja

14 Modelo de nucleación-polimerización
(Equilibrio entre las dos isoformas) PrPC PrPSc Incorporación de monóméros PrPSc (rápida) Nucleación (muy lenta) Núcleo infeccioso Estructura amiloide Fragmentación en núcleos infecciosos

15 Encefalopatías Espongiformes
Transmisibles Tiempo de incubación Años Diagnóstico preclínico No Prevención No Signos clínicos Neurológicos Tratamiento No Cura No Evolución Rápida Desenlace Fatal Diagnóstico definitivo Post mortem PrP

16 NH COOH Prusiner, Science 278: 245 (1997) ?

17 171 Polimorfismos en PrP animales Scrapie: 95% QQ171 Q Ovino Caprino
86 108 136 142 154 189 Q L A I H T Octapéptidos V M R R F V H Bovino Murino ELW/00

18 Esquema del gen PRNP de los ovinos

19 Polimorfismo del gen PRNP
Valina (V) Fenilalanina (F) Arginina (R) Arginina (R) Alanina (A) Leucina (L) Histidina (H) Glutamina (Q) Histidina (H)

20 Alelos y genotipos más frecuentes del gen PRNP
Nivel de Riesgo Polimorfismo RAZAS R1 ARR / ARR Charollais, Bleu de Maine, Bluefaced Leicester, Hampshire, Suffolk, Blackface, Cheviot, Texel R2 AHQ / AHQ ARR / AHQ Bluefaced Leicester, Blackface, Cheviot, Texel R3 AHQ / ARQ AHQ / ARH ARR / ARH Texel ARR / ARQ* Charollais, Bleu de Maine, Bluefaced Leicester, Texel Blackface, Cheviot, Hampshire , Suffolk R4 VRQ / ARR Blackface, Cheviot, Texel VRQ / ARH Charollais, Bleu de Maine, Texel VRQ / AHQ ARQ / ARQ Charollais, Bleu de Maine, Blackface, Cheviot ARQ / ARH ARH / ARH R5 VRQ / VRQ VRQ / ARQ Charollais, Bleu de Maine, Blackface, Cheviot,Texel

21 Grupos de riesgo de adquisición de Scrapie por resistencia / susceptibilidad genética
Genotipo Grupo NSP Grado de resistencia / susceptibilidad ARR / ARR 1 Ninguna restricción para su reproducción ARR / AHQ ARR / ARH ARR / ARQ 2 AHQ / AHQ ARH / ARH AHQ / ARH ARQ / ARH ARQ / AHQ ARQ / ARQ 3 Dependiendo de la raza, tiempo máximo para su venta o uso limitado para su reproducción en campos asociados a NSP ARR / VRQ 4 Prohibido su uso para reproducción dentro del plan NSP, tampoco para su venta. Reglamentación de castración / sacrificio del ovino ARQ / VRQ ARH / VRQ AHQ / VRQ VRQ / VRQ 5

22 P C R PCR - ELISA Secuenciación Determinación de genotipos
Manual o Automática PCR - RFLP PCR - ELISA Determinación de genotipos

23 Determinación de las frecuencias de genotipos

24 Determinación de las frecuencias de los diferentes alelos

25 Determinación de las frecuencias de los grupos de riesgo
Genotipo Grupo NSP Grado de resistencia / susceptibilidad Porcentaje ARR / ARR 1 Ninguna restricción para su reproducción 16,38 ARR / AHQ ARR / ARH ARR / ARQ 2 25,25 AHQ / AHQ ARH / ARH AHQ / ARH ARQ / ARH ARQ / AHQ ARQ / ARQ 3 Dependiendo de la raza, tiempo máximo para su venta o uso limitado para su reproducción en campos asociados a NSP 50,51 ARR / VRQ 4 Prohibido su uso para reproducción dentro del plan NSP, tampoco para su venta. Reglamentación de castración / sacrificio del ovino 1,36 ARQ / VRQ ARH / VRQ AHQ / VRQ VRQ / VRQ 5 6,48

26 Cepas de Scrapie 20 definidas por pasaje en ratón
- Nor 98: aislada de casos de campo: Definida por: - Clínica - Histopatología - “R” en 171: susceptible

27 Cepas de BSE 1: Italia BASE: Bovine Amyloidotic Spongiform Encephalopathy Casalone et al. Proc Natl Acad Sci 101:3065, 2004 2) Francia: Biacabe et al , EMBO reports, 5: 110, 2004 3) Japón??

28 “Distinct molecular phenotypes in bovine prion diseases”
“Molecular analysis of ovine prion protein identifies similarities between BSE and an experimental isolate of natural scrapie, CH1641”. Hope et al., J Gen Virol. 80: 1, 1999 “Distinct molecular phenotypes in bovine prion diseases” Biacabe et al , EMBO reports, 5: 110, 2004

29 Diagnóstico de EET

30 Solamente en el post mortem
“Test del tercer párpado” (in vivo) para “scrapie”

31 -Histopatología -Detección de PrP: Inmunohistoquímica
SAF Western Blot ELISA

32 Histopatología (Lesión espongiforme) Inmunohistoquímica (Depósitos de PrP)

33 SAF: Scrapie Associated Fibrils
En ovinos SAF: Scrapie Associated Fibrils

34 Medula Oblongata (Región del Obex)
1) Médula espinal 2) Cerebro 3) Región del Obex 4) Area utilizada para WB/ELISA 5) Muestra de elección

35 Tests rápidos BSE -Prionics Check Western -Prionics LIA
-TeSeE (BioRad) -CDI InPro - CediTect BSE Test - Enfer TSE Kit version 2.0, automated sample preparation - IDEXX HerdChek BSE Antigen Test Kit, EIA - Institut Pourquier Speed´it BSE - Prionics Check PrioSTRIP - Roboscreen Beta Prion BSE EIA Test Kit - Roche Applied Science PrionScreen Scrapie - IDEXX Herdchek - InPro CDI-5

36 Métodos utilizados en el Programa de Vigilancia de Argentina
Métodos de referencia: -Histopatología -Inmunohistoquímica -Western blot Test rápidos: -Western blot (Prionics) - Enfer TSE (ensayo piloto-2003)

37 Algunos métodos en estudio (in vivo)
Detección de PrPSc en sangre (Scherr et al., J. Chromat 697: 223, 1997) Unión de PrPSc a plasminógeno en soporte sólido (Fischer et al., Nature 408: 479, 2000) Detección de PrPSc en orina (Shaked et al., J Biol Chem 276: 31479, 2001) “Protein misfolding cyclic amplification” (Saborio et al. Nature 411: 810, 2001) Detección de secuencias cortas de ADN asociadas a EET en sangre ( Schütz et al, Clin Diagn Lab Inmunol. 12 (7): , 2005)

38 Laboratorio de referencia para el diagnóstico de EET de animales
B. J. Carrillo F.J. Blanco Viera E. L. Weber M. Alegre F. Capellino F. Delgado S. Duffy D. Funes L. Jiménez E. León A. Marcos S. Martínez G. Pinto C. Soto C. Vallejos C.Hirschvogel G. Figueroa S. Carceller A. Elisei Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas Castelar

39 GRACIAS