UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA INSTITUTO DE INVESTIGACIONES EN CIENCIAS VETERINARIAS LABORATORIO DE SALUD PÚBLICA VETERINARIA II Congreso Internacional.

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1 UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA INSTITUTO DE INVESTIGACIONES EN CIENCIAS VETERINARIAS LABORATORIO DE SALUD PÚBLICA VETERINARIA II Congreso Internacional de Leptospirosis, Sífilis y Borreliosis "Espiroquetas Habana 2012" de abril de 2012 La Habana, Cuba Borreliosis (Borrelia burgdorferi) y factores de riesgo en perros de una ciudad que sólo ha reportado garrapatas Rhipicephalus sanguineus en caninos, Mexicali, Baja California, México Luis Tinoco Gracia

2 SAPUVETNET Red auspiciada por el Grupo Alfa de la Unión Europea
Integrada por 16 países de América Latina y Europa

3 Mexicali, Baja California, México

4 INTRODUCCIÓN BORRELIOSIS (ENFERMEDAD DE LYME):
Enfermedad inflamatoria multisistémica Transmitida por garrapatas Zoonótica Distribución mundial ETIOLOGÍA: Complejo Borrelia burgdorferi sensu lato. Norteamérica: B. burgdorferi sensu stricto (Johnson, 1984). Europa: B. afzelli y B. garinii (Berglund, 1995; Derdáková, 2003). Asia: B. japonica (Kawabata, 1993).

5 BANCO DE GENES National Center for Biotechnology Information (NCBI)

6 Ciclo biológico de I. scapularis relacionado con B. burgdorferi
Transmisión de borrelias al huésped por garrapata adulta Huevos Larvas Transmisión de borrelias al huésped por ninfas Reservorio Otros vectores: I. pacificus, A. americanum, D. variabilis

7 BORRELIOSIS: Enfermedad inflamatoria multisistémica
Depresión, emaciación Claudicación Garrapatas

8 ANTECEDENTES DE PREVALENCIA EN PERROS
Monterrey, Nuevo León: 16% (136/850) a B. burgdorferi por IFA (Salinas-Meléndez et al., 1999) Mexicali, B. C.: 6.6% (2/30) a B. burgdorferi por ELISA (Romano et al., 1998) 8.2% (95% I.C %) a B. burgdorferi por ELISA (Tinoco et al., 2007) 59.6% (56/94) a garrapatas (100% Rhipicephalus sanguineus) (Tinoco et al., 2008)

9 ANTECEDENTES DE PREVALENCIA EN HUMANOS
Estados Unidos: Actualmente: 200,000 (CDC) República Mexicana: Por ELISA y Western blot Distrito Federal: 3.4% Noreste de la Rep. Mexicana: 6.2% (Gordillo et al., 2003) Por PCR y Secuenciación (Flagelina y OspA) Distrito Federal: 4 pacientes (Gordillo et al., 2007)

10 OBJETIVOS Estimar la prevalencia de B. burgdorferi por ELISA y PCR en perros atendidos en clínicas veterinarias y en perros capturados por los centros de control animal; y demostrar evidencia molecular en garrapatas por PCR, en Mexicali, Baja California, México. Evaluar factores de riesgo asociados a B. burgdorferi en perros de la zona urbana de Mexicali, Baja California. Demostrar la transmisión experimental de B. burgdorferi a través de la garrapata adulta R. sanguineus en perros.

11 MATERIAL Y MÉTODOS FASES DEL TRABAJO DE INVESTIGACIÓN
Monitoreo de B. burgdorferi. Aislamiento de B. burgdorferi. Estudio experimental de la transmisión de B. burgdorferi por R. sanguineus.

12 1. MONITOREO MARCO MUESTRAL DEL AREA DE ESTUDIO Establecimientos:
39 clínicas veterinarias de la ciudad de Mexicali 2 centros de control animal de Mexicali Sujetos: (768) i) 384 Perros atendidos en clínicas veterinarias ii) 384 Perros capturados por los centros de control animal iii) Garrapatas recolectadas de los animales muestreados

13 Muestreo sanguíneo y de garrapatas
Perros atendidos en clínicas veterinarias Perros capturados por los centros de control animal Garrapatas conservadas en tubos con etanol al 70% o congeladas a -20°C.

14 DIAGNÓSTICO PERROS Serología: Borrelia burgdorferi ELISA® Helica Biosystems, Inc. PCR: Sangre y líquido sinovial GARRAPATAS PCR: Glándula salival e intestino. Iniciadores: Fragmentos de genes codificantes de B. burgdorferi sensu lato a) Flagelina (FLA): pb b) Proteína A de la superficie externa (OspA): 345 pb

15 SEROLOGÍA DE Borrelia burgdorferi PUNTO DE CORTE
Densidad öptica > 1.6 1.0 – 1.5 Positivo 0.5 – 1.0 0.3 – 0.5 Corte 0.2 – 0.3 Negativo 0.1 – 0.2 <0.1 Sensibilidad = 95.8% Especificidad = 94.7% Punto de corte = DO (Densidad óptica)

16 ANÁLISIS ESTADÍSTICO 1. Tamaño de muestra:
n = tamaño de muestra, resultando 384 por cada grupo de estudio.  = estimador de varianza máxima 50 % Z = valor de tablas = 1.96 d = precisión = 5 % (Scheafer et al., 1987) 2. Se estimó la prevalencia y su intervalo de confianza mediante el estimador Rogan-Gladen (Greiner y Gardner, 2000). 3. Para evaluar la asociación de los factores de riesgo con la seropositividad a B. burgdorferi se utilizaron la razón de probabilidades (Odds ratio, OR) y X2 de Mantel-Haenszel. 4. Todos los análisis estadísticos utilizando el paquete SAS (Statistical Analysis System) para Windows ver 8.2 (Walker, 1997; SAS, 2004).

17 RESULTADOS Seroprevalencia ajustada de Borrelia burgdorferi ELISA® Helica Biosystems, Inc. Perros atendidos en clínicas veterinarias: / % (95% CI ) Perros capturados por los centro de control animal: 42/ % (95% CI ) Ambos grupos: / % (95% CI )

18 FACTORES DE RIESGO Perros de las clínicas veterinarias
Parámetro X P OR (95% IC ) Edad ( ) Falta de programa preventivo ( )

19 EVIDENCIA MOLECULAR DE Borrelia burgdorferi - PCR
Manhattan, Kansas, 26 de septiembre de 2007 PCR de FLA en sangre de perros seropositivos 256 pb 256 pb 256 pb

20 EVIDENCIA MOLECULAR DE Borrelia burgdorferi - PCR
Manhattan, Kansas, 29 de septiembre de 2007 PCR de FLA en tejidos de perros seropositivos 256 pb 256 pb

21 EVIDENCIA MOLECULAR DE Borrelia burgdorferi - PCR
Manhattan, Kansas, 30 de septiembre de 2007 PCR de OspA en tejidos, coágulos sanguíneos y garrapatas de perros seropositivos 345 pb 1. Marcador 2. C+ N40 Coágulos sanguíneos Sero+ FLA+ Coágulos sanguíneos Sero+ FLA+ Coágulos sanguíneos Sero+ FLA+ Coágulos sanguíneos Sero+ FLA+ M, sinovial Sero+ FLA+ M, sinovial Sero+ FLA+ 9. ENS1 M, sinovial Sero+ FLA+ CA M, sinovial Sero+ FLA+ Garrapatas Sero+ FLA+ Garrapatas Sero+ FLA+ 13. C-

22 EVIDENCIA MOLECULAR DE Borrelia burgdorferi - PCR
Mexicali, B.C., 22 de octubre de 2007 PCR de FLA en tejidos de perros seropositivos M 1 2 3 4 5 6 7 P N 256 pb

23 EVIDENCIA MOLECULAR DE Borrelia burgdorferi - PCR
M Marcador BioLadder 100 889 Coágulos sanguíneos 2063 Coágulos sanguíneos 1272 Coágulos sanguíneos 1368 Garrapatas 1272 Vejiga P. Positivo N. Negativo M. Marcador BioLadder 100 Mexicali, B.C., 19 de marzo de 2008 PCR de FLA en tejidos y garrapatas de perros seropositivos M P N M 256 pb

24 EVIDENCIA DE Borrelia burgdorferi - Secuenciación Manhattan, Kansas, 17 de octubre de 2007
Perro #1312  Muestra: Coágulo sanguíneo 100% de identidad con OspA de Borrelia burgdorferi TAACAATTTCTGACGATCTAGGTCAAACCACACTTGAAGTTTTCAAAGAAGATGGCAAAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CACTAGTATCaaaaaaaGTAACTTCCAAAGACAAGTCATCAACAGAAGAAAAATTCAATG CACTAGTATCAAAAAAAGTAACTTCCAAAGACAAGTCATCAACAGAAGAAAAATTCAATG AAAAAGGTGAAGTATCTGAAAAAATAATAACAAGAGCAGACGGAACCAGACTTGAATACA CAGAAATTAAAAGCGATGGATCTGGAAAAGCTAAAGAGGTTTTAAAAGGCTATGTTCTTG AAGGAACTCTAACTGCTGAAAAAACAAC ||||||||||||||||||||||||||||

25 2. AISLAMIENTO Medio de cultivo: BSK-H® SIGMA + suero de conejo (6%) + gelatina de cerdo (6%) + rifampicina (100 mg/L) + fosfomicina (50 mg/L) + anfotericina B (2.5 mg/L) Fuente: Vejiga. Temperatura: 33°C Comprobación de crecimiento: Microscopia de campo obscuro Criopreservación : -20°C (CryoCare Bacterial Preservers® Key Scientific Products) Secuenciación: 99% Borrelia burgdorferi sensu stricto

26 3. TRANSMISION EXPERIMENTAL
3 perros sanos de 8 meses de edad, de talla mediana, pelaje corto. a) Grupo A: 2 perros expuestos a R. sanguineus con B. burgdorferi. b) Grupo B: 1 perro expuesto a R. sanguineus no infectadas.

27 Incubación y desarrollo de R. sanguineus
Recolección de hembras adultas repletas recién alimentadas. Preovoposición: d. Ovoposición: d. Incubación de huevos: d. Ayuno: d. Colocación de larvas en perros: d. Muda de larvas a ninfas: d. Colocación de ninfas en perros: d. Muda de ninfas a adultas: d. Ayuno: d. Inoculación de borrelias en hembras adultas: 1 d. Colocación de garrapatas adultas en perros: 7 d. Total del ciclo: d. Incubación: 30°C con 80% de humedad.

28 CICLO DE R. sanguineus EN MEXICALI

29 Inoculación de B. burgdorferi en R. sanguineus
5 hembras adultas inoculadas/perro. El inóculo fue por capilaridad con medio BSK-H y Borrelia burgdorferi. Concentración: 1×108 espiroquetas/ml de BSK-H. En cámara húmedad a 34°C durante 24 horas.

30 Exposición experimental en perros a R. sanguineus
infectadas con B. burgdorferi Colocación de 5 machos y 5 hembras adultas/perro. Duración: 7 días.

31 CONCLUSIONES Seroprevalencia de 6.8% (95% IC %) a B. burgdorferi en perros atendidos en clínicas veterinarias. Seroprevalencia de 12% (95% IC %) en perros capturados por los centros de control animal. Perros ≥ 1 año de edad: OR= 2.7 (95% IC ). Perros que no tuvieron acceso a un programa preventivo: OR= 4.9 (95% IC ). Evidencias serológicas y moleculares confirman la existencia de B. burgdorferi en perros y garrapatas en donde sólo se han registrado R. sanguineus. Hasta el momento no se ha comprobado la transmisión de B. burgdorferi por garrapatas adultas de R. sanguineus en perros utilizando el protocolo para Ixodes scapularis.

32 Modificación del protocolo de la transmisión experimental de B
Modificación del protocolo de la transmisión experimental de B. burgdorferi a través de R. sanguineus: Utilizar 5 µL de medio BSK-H con 1×108 espiroquetas/ml como inóculo en lugar de 20 µL. Realizar la inoculación de borrelias incluyendo la fase de ninfa no sólo la adulta. Inocular con borrelias a 30 garrapatas hembras en lugar de 5 por cada perro de experimentación.

33 GRACIAS Mexicali, Baja California, México