 Los PHD-fingers de CHD5 reconocen específicamente cola N-terminal no modificada de la histona H3.  Chip y micro array de CHD5  CHD5 es blanco directo.

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1  Los PHD-fingers de CHD5 reconocen específicamente cola N-terminal no modificada de la histona H3.  Chip y micro array de CHD5  CHD5 es blanco directo de miR-211. La sobreexpresión de miR-211 promueve el crecimiento de las células tumorales al menos en parte por la reducción de la expresion de CHD5.  Las mutaciones somaticas adquiridas del gen CHD5 son poco frecuentes en neuro-blastoma y la inactivación se por deleción y/o metilación del promotor.  En NB, la expresión de CHD5 y la metilación de su promotor están asociados a la amplificación de MYC.  La elevada expresión de CHD5 está fuertemente correlacionada con la evolucion favorable del NB.  La reducción de la expresión de CHD5 mediada al menos por metilación de su promotor contribuye al desarrollo y la progresión del cancer de mama.  La reducida expresión de CHD5 es un marcador prognostico negativo en cancer de vesícula primario.  CHD5 es un importante supresor tumor (TSG) en Endometriosis.  En cancer de pulmón, CHD5 es un TSG silenciado por metilación del promotor.  En cancer gástrico, CHD5 es un TSG silenciado por metilación del promotor.  hsa-mir-1202 aprareció con 4 reads en 3 experimentos de deep sequencing en squamous cell.  hsa-mir-1203 aprareció con 1 read en 1 experimento de deep sequencing en cervix normal.  has-mir-1201 sería un snoRNA.  Los PHD-fingers de CHD5 reconocen específicamente cola N-terminal no modificada de la histona H3.  Chip y micro array de CHD5  CHD5 es blanco directo de miR-211. La sobreexpresión de miR-211 promueve el crecimiento de las células tumorales al menos en parte por la reducción de la expresion de CHD5.  Las mutaciones somaticas adquiridas del gen CHD5 son poco frecuentes en neuro-blastoma y la inactivación se por deleción y/o metilación del promotor.  En NB, la expresión de CHD5 y la metilación de su promotor están asociados a la amplificación de MYC.  La elevada expresión de CHD5 está fuertemente correlacionada con la evolucion favorable del NB.  La reducción de la expresión de CHD5 mediada al menos por metilación de su promotor contribuye al desarrollo y la progresión del cancer de mama.  La reducida expresión de CHD5 es un marcador prognostico negativo en cancer de vesícula primario.  CHD5 es un importante supresor tumor (TSG) en Endometriosis.  En cancer de pulmón, CHD5 es un TSG silenciado por metilación del promotor.  En cancer gástrico, CHD5 es un TSG silenciado por metilación del promotor.  hsa-mir-1202 aprareció con 4 reads en 3 experimentos de deep sequencing en squamous cell.  hsa-mir-1203 aprareció con 1 read en 1 experimento de deep sequencing en cervix normal.  has-mir-1201 sería un snoRNA. Últimos avancesPCR

2 Detección de los miRNAs 1201, 1202 y 1203 Caracterización de los niveles de expresión de los miRNAs. Detección del ARNm de CHD5 Detección de CHD5 Caracterización del niveles de expresión de CHD5. Alteración de los niveles de los miRNAs Respuesta en los cultivos celulares Respuesta en la expresión de CHD5 Especificidad de la regulación de los miRNAs Respuesta en la expresión de genes regulados por CHD5: P53 p19 Respuesta en la expresión de genes regulados por CHD5: P53 p19 Caracterización de los niveles de expresión de los miRNAs en muestras de pacientes con LLC Caracterización del niveles de expresión de CHD5 en muestras de pacientes con LLC PCR real time PCR western blot inmunoprecipitación transfección con oligos sintéticos sense y anti-sense apoptósis viabilidad western blot northern blot inmunofluorescencia western blot luciferasa Estrategia Proyecto Análisis de las semillas en el 3’UTR de CHD5 real time PCR

3 1203 sh, 1203HeLa, C- 1203 1201 sh, 1201 HeLa, C- 1201 1202 sh, Ladder, 1202HeLa, C- 1202 CHD5 set1, C- set1 GAPDH sh, GAPDH HeLa, C- GAPDH 1203 sh, 1203HeLa, C- 1203 1201 sh, 1201 HeLa, C- 1201 1202 sh, Ladder, 1202HeLa, C- 1202 CHD5 set1, C- set1 GAPDH sh, GAPDH HeLa, C- GAPDH Detección de miRNAsPCR

4 1) ARN total, tejido neural de rata 2) ARN total, Jurkat 3) ARN total, Daudi 4) ARN total, SKN-AS 5) ARN total, SKN-BE2. FastRuler DNA Ladder High Range, Fermentas (#SM1128). 1) ARN total, tejido neural de rata 2) ARN total, Jurkat 3) ARN total, Daudi 4) ARN total, SKN-AS 5) ARN total, SKN-BE2. FastRuler DNA Ladder High Range, Fermentas (#SM1128). Detección ARNm CHD5 Northern-blott PC R

5 Detección ARNm CHD5PCR tiempo real Set1 Set2Set3 Set1 Set2Set3 SH Set 1: Comprende sólo 1 exon Set 2: Levanta CHD3 Set 3: El indicado

6 AbcamSanta Cruz 0,15 % tween 75 µg beads75 µl beads 2 µg Anticuerpo 500 µg proteína Detección CHD5 Inmuno-precipitación

7 Control 1203 AS1202 AS1201 AS 1203 S 1202 S1201 S Lipofectamina 2000 Transfecciones de los miRNAsSK-N-SH

8 50 nM de miARNs 2 ml/ml de lipofectamina SK-N-SH 50 nM de miARNs 2 ml/ml de lipofectamina Transfecciones de los miRNAsSK-N-SH

9 HeLa 50 nM de miARNs 2 ml/ml de lipofectamina. HeLa 50 nM de miARNs 2 ml/ml de lipofectamina. Transfecciones de los miRNAsHeLa

10 Viabilidad en HeLa Cristal violeta Viabilidad en HeLa Cristal violeta Viabilidad celular Efecto de los miRNAs Controles SenseAnti-sense - - X X + +

11 HeLa Citometría de flujo 24 horas post-transfección. HeLa Citometría de flujo 24 horas post-transfección. Apoptósis Efecto de los miRNAs X + + + - X

12 Control 1203 AS1202 AS 1201 AS 2.59 5.34 11.86 5.35 Apoptósis Efecto de los miRNAs

13 Regulación de CHD5Luciferasa X + - 1201 1203 1201 1202 X X - + + - + + X

14 Regulación de CHD5Luciferasa 1202 Sin inserto X + + - - X + + X -

15 X + - 1201 1203 - + + + X + + X X

16 1201 1202 X X - + + X + - X X - -

17 + + - X + + X + + + X X + + X X

18 Regulación de CHD5Luciferasa Sin corrección por V0 I (1201 - 1203) II (1202 - 1201) III (1202 - 1202) 1201s+XX 1201asXX- 1202s+-- 1202as+++ 1203s-XX 1203as-++ Con corrección por V0 I (1201 - 1203) II (1201 - 1202) III (1202 - 1202) 1201s+-X 1201asXXX 1202s+-+ 1202asXX X+X+X+X+ 1203s+-+ 1203asX+ X+X+X+X+

19 CHD5 3’UTR (nt 1017-1023) 5’...GCCUACCCUGCCCACCUCCGGAG... |||||| miR-1203 3’ CUCGACGUAGGACCGAGGCCC CHD5 3’UTR (nt 1314-1338) 5' ACGGAG-ATGGGGAGCAGGTCAGGCC 3' :||| ||| | ::|||||| miR-1201 3' AGTCTCGTACAC--AAATTAGTCCGA 5' CHD5 3’UTR (nt 1863-1869) 5'...GCUCUGCGGUGCCUCCUGGCAAA... |||||| miR-1202 3' GAGGGGGUGACGUCGACCGUG CHD5 3’UTR (nt 2087-2093) 5’...CUGUGCGCCUUCCUCUCAGGCAG... |||||| miR-1201 3’ AGUCUCGUACACAAAUUAGUCCGA CHD5 3’UTR (nt 3020-3026) 5‘...UGGGUGGGGGCCGAGGCUGGCAC... ||||||| miR-1202 3‘ GAGGGGGUGACGUCGACCGUG CHD5 3’UTR (nt 3448-3454) 5'...CAGGCACAGCCCCAG----GCUGGCAA... ||||| ||||||| miR-1202 3' GAGGGGGUGACGUCGACCGUG psiCHECK-2_1/3 (i) psiCHECK-2_1/2 (ii) psiCHECK-2_2/2 (iii)

20 Regulación de CHD5Western Blot CHD5 SHCHD5 HeLa 1201s-- 1201asx- 1202s+- 1202as+- 1203s+x 1203asx+

21 Regulación de CHD5Inmunofluorescencia HeLa 48 horas post-transfeccion. 50 nM de los oligonucleotidos sintéticos. Rabbit anti-CHD5 (santa cruz) Anti-Rabbit Alexa fluor 488. HeLa 48 horas post-transfeccion. 50 nM de los oligonucleotidos sintéticos. Rabbit anti-CHD5 (santa cruz) Anti-Rabbit Alexa fluor 488.

22 Regulación de CHD5Inmunofluorescencia SH 48 horas post-transfeccion. 50 nM de los oligonucleotidos sintéticos. Rabbit anti-CHD5 (santa cruz) Anti-Rabbit Alexa fluor 488. SH 48 horas post-transfeccion. 50 nM de los oligonucleotidos sintéticos. Rabbit anti-CHD5 (santa cruz) Anti-Rabbit Alexa fluor 488.

23 p53 Gapdh 120312011202120312021201Pool ASControlPool S AS S Regulación de p53Western Blot WI38

24 VI 1201 1203 VII 1202 1201 VIII 1202 VI 1201 1203 c VII 1201 1202 c VIII 1202 c Western CHD5 SH Western CHD5 HeLa Apoptosis HeLa Viabilidad HeLa Inmuno HeLa Inmuno SH p53 1201s+XX+-X--XX+++ 1201asXX-XXXX-+++++ 1202s+--+-++---+++ 1202as+++XX X+X+X+X++-+-+++ 1203s-XX+-++xXX+++ 1203as-++X+ X+X+X+X+x++++++ Resumen