Resina: rProtA producida en E. coli

Presentación del tema: "Resina: rProtA producida en E. coli"— Transcripción de la presentación:

1 Resina: rProtA producida en E. coli
“High capacity, low ligand leakage and specially developed base matrix make MabSelect ideal for purification of monoclonal antibodies at process scale”

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3 ConA-Sepharose Lectinas: proteínas que interaccionan específicamente y de manera reversible con ciertos residuos de azúcares. Se utilizan para aislar y separar glicoproteínas, glicolípidos, polisacáridos. Con A es una metalloproteina tetramérica aislada de Canavalia ensiformis (jack bean). Con A se une a moléculas que contienen residuos de manosa o glucosa, y residuos relacionados estéricamente. Para mantener las características de unión de la Con A Sepharose, es esencial la presencia de Mn2+ y Ca2+ (1-5 mM). La elución de las sustancias unidas se puede realizar con un gradiente creciente (linear o en pasos) de α-D-metilmanósido or α-D-metilglucósido. Estos azúcares actúan como eluyentes fuertes. Muchas sustancias eluyen a M pero para sustancias unidas fuertemente se pueden requerir concentraciones más elevadas. Glucosa y manosa también se pueden usar pero son eluyentes más débiles.

4 ConA-Sepharose

5 Application: Enrichment of glycoproteins from human plasma

6 Cromatografía de afinidad: proteínas recombinantes
La purificación de proteínas recombinantes a menudo se puede simplificar incorporando una etiqueta. Además de proporcionar un marcador para la expresión y facilitar la detección de la proteína recombinante, un papel importante para la etiqueta es permitir una purificación simple mediante cromatografía de afinidad. Las dos etiquetas más utilizadas son la glutatión-S-transferasa (GST) y 6 residuos de histidina (His) 6.

7 Proteínas recombinantes con tags de 6xHis: cromatografía de quelatos metálicos inmovilizados (IMAC)
La matriz tiene unido covalentemente un quelante de metales, como el ácido iminodiacético. Se carga la columna con un ión adecuado, que puede ser Ni2+, Co2+, Zn2+, Cu2+. La proteína se adsorbe a la columna si tiene residuos agrupados de His, Cys o Trp. Se eluye compitiendo con imidazol. Eventualemente se pueden utilizar también para la elución quelantes (EDTA) o bajar el pH a 4 – 6. Esta técnica es muy usada actualmente para purificar proteínas recombinantes, expresandolas como fusiones con un “tag” de poly-His (en general 6 residuos), que pueden agregarse en el N o en el C-terminal. Si todo funciona bien, se puede tener proteína recombinante con alto grado de pureza en un solo paso de purificación. Debe tenerse en cuenta los metales pueden catalizar la oxidación de grupos en la proteína, en especial de –SH.

8 Purificación de proteínas recombinantes fusionadas a GST
El sistema de etiquetas de afinidad Glutathione S-transferase (GST) es un sistema completo y versátil de para la expresión, purificación y detección de proteínas marcadas con GST producidas en E. coli. El sistema consta de tres componentes principales: vectores pGEX, resinas para purificar GST y un kit de detección de GST. Una serie de proteasas específicas del sitio complementa el sistema. Los vectores pGEX están diseñados para la expresión intracelular inducible de genes como fusiones con GST. La expresión en E. coli produce proteínas marcadas con la GST en el extremo amino y la proteína de interés en el extremo carboxilo. El método de purificación se basa en la afinidad de GST al ligando glutatión acoplado a una matriz. La unión de una proteína marcada con GST al ligando es reversible, y la proteína puede eluirse en condiciones suaves y no desnaturalizantes mediante la adición de glutatión reducido. La técnica proporciona así un proceso de purificación suave que no afecta la estructura y función nativa de la proteína.

9 Cromatografía de Afinidad a Glutation-Sepharose

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11 Acoplamiento a través de la amina primaria de un ligando: NHS-activated Sepharose

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13 Dissolve the ligand in the coupling buffer (0. 2 M NaHCO3, 0
Dissolve the ligand in the coupling buffer (0.2 M NaHCO3, 0.5 M NaCl, pH 8.3) to a final concentration of 0.5–10 mg/ml (for protein ligands)

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15 Acoplamiento a través de la amina primaria de un ligando: CNBr-activated Sepharose

16 Acoplamiento a través de gruppos hidroxi, amino o tiol: Epoxy-activated Sepharose 6B

17 Coupling through hydroxy, amino or thiol group: Epoxy-activated Sepharose 6B

18 Coupling through a thiol group Thiopropyl Sepharose 6B
Thiol-containing substances can be isolated selectively by covalent binding to an activated thiolated matrix via thiol-disulphide exchange to form a mixed disulphide bond. After washing away unbound material, the thiol-containing substance is eluted by reducing the disulphide bond. If the proteins to be purified contain disulphide bonds, the disulphide bridges must be reduced, for example with 2-mercaptoethanol (5 mM). The coupling reaction can be monitored and, in some cases, quantified by following the appearance of 2-thiopyridone in the eluent at 343 nm during the purification. Resolve different thiol proteins by sequential elution: 5–25 mM L-cysteine < 0.05 M glutathione < 0.02–0.05 M 2-mercaptoethanol < and 0.02–0.05 M dithiothreitol. Reactivation: Pass one to two column volumes of a saturated solution (approximately 1.5 mM) of 2,2’-dipyridyl disulphide, pH 8.0 through the medium. Principio de la cromatografía covalente basada en el 2-piridil disulfuro

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20 TIPOS DE CROMATOGRAFÍA
Según la presión a que se opera la corrida, se pueden considerar tres tipos: Corridas a presión normal (LPLC, low-pressure liquid chromatography). Presión inferior a 5 bar. Pueden usarse matrices de escasa rigidez, como la agarosa o el dextrano. Corridas a presión intermedia (MPLC, medium-pressure liquid chromatography, tambien llamada FPLC (Fast protein liquid chromatography). Presión entre 6 y 50 bar. Requiere matrices mas rígidas. Permite flujos mayores. Corridas a alta presión (HPLC, high-pressure - o high-performance - liquid chromatography). Presiones mayores de 50 bar. Requiere matrices de rigidez alta, partículas pequeñas y columnas y tuberías de material altamente resistente a la presión, como el acero inoxidable o el titanio. 1 Atm corresponde a milibars

21 CARACTERÍSTICAS TÍPICAS DE LPLC Y HPLC
Tamaño de partícula (µm) 100 10 Flujo (ml.cm-2.h-1) 10-30 Presión de trabajo (bar) < 5 > 50 Tiempo de separación (hs) Hasta 24 1 – 3 Volumen de muestra ml – l µl – ml Etapa de purificación Variable En general tardía Resolución Buena Excelente Dificultades Largo tiempo, cámara fría Alto costo de equipo, posible desnaturalización por presión

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24 Generación del gradiente para la elución en LPLC

25 REMOCIÓN DE SALES Y CAMBIO DE BUFFER
Diálisis Diafiltración (ultrafiltración y cambio de buffer) Filtración por gel (G-25, PD-10)

26 PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS DE MEMBRANA
1) Es fundamental determinar el modo de asociación de la proteína de interés con la membrana ya que de ello dependerán los métodos adoptados para su purificación. Las proteínas periféricas (o extrínsecas) están asociadas a la membrana a través de interacciones con otras proteínas o con las regiones expuestas de los fosfolípidos. En estos casos, la proteína puede a menudo ser disociada de la membrana alterando las condiciones iónicas del buffer o, en situaciones más resistentes, induciendo un cierto grado de desnaturalización. Aunque los detergentes pueden ayudar a liberar este tipo de proteínas, no suelen ser requeridos en los pasos subsiguientes. La liberación de las proteínas integrales de membrana (o intrínsecas) en una forma soluble requerirá la disrupción de la bicapa fosfolipídica o el clivado de su anclaje a membrana. Si una parte sustancial de la proteína se encuentra dentro de la bicapa lipoídica, durante todas los procedimientos de purificación posteriores se requerirá “proteger” las regiones hidrofóbicas de su exposición al medio acuoso, por lo que normalmente se usan detergentes. 2) El paso inicial más valioso consiste en tener una preparación de la membrana de interés tan pura como sea posible. Inducción de shedding, fraccionamiento de membranas, centrifugación en gradiente de densidad, etc

27 Six ways in which membrane proteins associate with the lipid bilayer
Six ways in which membrane proteins associate with the lipid bilayer. Most trans-membrane proteins are thought to extend across the bilayer as a single a helix (1) or as multiple a helices (2); some of these "single-pass" and "multipass" proteins have a covalently attached fatty acid chain inserted in the cytoplasmic monolayer (1). Other membrane proteins are attached to the bilayer solely by a covalently attached lipid - either a fatty acid chain or prenyl group - in the cytoplasmic monolayer (3) or, less often, via an oligosaccharide, to a minor phospholipid, phosphatidylinositol, in the noncytoplasmic monolayer (4). Finally, many proteins are attached to the membrane only by noncovalent interactions with other membrane proteins (5) and (6).

28 SOLUBILIZACIÓN DE PROTEÍNAS DE MEMBRANA
Proteínas de membrana periféricas - Se utilizan tratamientos suaves (buffers de baja fuerza iónica conteniendo mM EDTA o bufferes de alta fuerza iónica conteniendo hasta 1M NaCl o KCl. Para prevenir la desnaturalización irreversible de proteínas, el pH debería estar en el rango 6-8 y las incubaciones deben hacerse en hielo. Incluir inhibidores de proteasas. - Condiciones más drásticas (6M clorhidrato de guanidina, 8M urea, ácidos pH 2-3 o bases pH diluidas) usualmente conducen a la desnaturalización de las proteínas, a menudo irreversiblemente.

29 SOLUBILIZACIÓN DE PROTEÍNAS DE MEMBRANA
Proteínas de membrana integrales - Las que tienen una parte soluble sustancial, pueden ser solubilizadas cortando la parte que las ancla en la membrana con fosfolipasas o proteasas, según de qué ancla se trate. Las integrales de membrana que poseen una parte sustancial de la proteína inmersa en la bicapa lipídica se extraen por delipidación con solventes orgánicos, agentes caotrópicos o detergentes. Detergentes: Moléculas anfifílicas, relativamente pequeñas. Por encima de la concentración micelar crítica las moléculas coalescen a través de su parte hidrofóbica para formar micelas, en equilibrio con el monómero.

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31 Non ionic detergents have a hydrophilic head group that is uncharged and are preferred for their ability to break lipid-lipid and lipid-protein interactions. They have limited ability to break protein-protein interactions and are often referred to as non-denaturing detergents and are used to isolate biologically active membrane proteins.

32 Zwitterionic detergents protect the native state of proteins without altering the native charge of the protein molecules. Zwitterionic detergents are used for isoelectric focusing and 2D electrophoresis.

33 Ionic detergents are used for complete disruption of cellular structure and denaturing of proteins for separation during gel electrophoresis. Ionic detergents bind with protein molecules masking their native charge and rendering the protein molecules the overall charge of the ionic detergent.

34 Actualmente se usa mucho el Triton X-114, que tiene la propiedad de ser miscible con el agua a 0 - 4oC, pero se separa en dos fases a oC. Las proteínas integrales, solubilizadas a baja temperatura, particionan en la fase de detergente al llevarlas a oC.

35 PURIFICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS SOLUBILIZADAS
Las proteínas periféricas (o los fragmentos hidrofílicos de proteínas integrales) en general se purifican por los mismos métodos que los usados para las solubles. Las proteínas integrales presentan problemas especiales, debido a que requieren la presencia continua de detergentes o solventes orgánicos. La filtración por gel puede aplicarse; prácticamente todos los materiales para esta técnica pueden usarse en presencia de detergentes o desnaturalizantes, y existen algunas resinas (poliéteres hidroxilados, dextranos hidroxipropilados) admiten solventes orgánicos. La cromatografía de intercambio iónico y el cromatoenfocado pueden utilizarse, en presencia de detergentes no iónicos. La cromatografía en fase reversa en algunos casos puede aplicarse, con la muestra solubilizada en ácido fórmico al % en agua. La cromatografía de afinidad es aplicable en general, requiriéndose a veces resinas de altas porosidad y brazos espaciadores largos.