FASE ANALITICA LINA MARIA OSPINA GALLEGO. Métodos para medir la [] de una sustancia por Espectrofotometría.

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1 FASE ANALITICA LINA MARIA OSPINA GALLEGO

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3 Métodos para medir la [] de una sustancia por Espectrofotometría

4 Punto final o de equilibrio Se incuba la muestra y el reactivo durante un tiempo determinado y a una temperatura determinada para que se complete totalmente la reacción, de tal forma que la sustancia que buscamos debe consumirse totalmente. Métodos cinéticos En ellos se mide la velocidad de la reacción mediante la medida de la variación de la Absorbancia en el tiempo y esto se relaciona con la concentración. Es una medición continua, a diferencia de la del punto final, se mide en tiempos regulares.

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6 COMPONENTES EN QUIMICA CLINICA DE LA FASE ANALITICA Blanco: Es la Medición de la absorción de luz (longitud de onda) propia del tubo o la cubeta de reacción; la cual es restada de la lectura final de la reacción; entre la muestra y los reactivos después de un tiempo de incubación indicado Calibrador: Sustancia especifica de concentración conocida que se usa en lugar de la muestra, para determinar el “Factor de calibración” en una reacción Química (ej. Determinación de glucosa; creatinina. Etc), el cual ayuda a “corregir) todas las lecturas posteriores a la calibración. Solución Patrón: de concentración conocida de una sustancia se emplea para obtener datos de absorbancia de referencia para calcular la concentración del parámetro en la muestra problema. Corrida: Conjunto de muestras analizadas en forma continua, bajo las mismas condiciones experimentales.

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11 Control de Primera Opinión Control correspondiente a la misma marca de Reactivo utilizado en un análisis. Estos controles están diseñados solo para usarse en sus propios sistemas de prueba, pero lo más importante es que muchas veces son manufacturados con los mismos materiales que los calibradores, por lo tanto, en estos casos es frecuente que el control imite el comportamiento del calibrador haciéndolo menos sensible a los cambios en el desempeño del instrumento. Esto puede provocar la validación de resultados de pacientes con un error analítico significativo, entregando al paciente resultados sin utilidad médica. Frecuentemente, un laboratorio recibe un lote diferente del control “in kit” o del fabricante con cada cambio del lote del reactivo, esto impide al laboratorio llevar un seguimiento a largo plazo del CC

12 Control de tercera opinión Control diferente a la casa comercial a la utilizada en el reactivo de la prueba Los controles de tercera opinión, ayudan a proporcionar una valoración independiente del equipo o método y no está optimizado para ningún instrumento o sistema de reactivos específicos. son fabricados independientemente de los reactivos y calibradores del sistema. Dichos controles generalmente están fabricados con base en una matriz humana, lo cual nos brinda un producto similar a una muestra de paciente. Presentan amplias caducidades, permiten el uso del mismo lote de control cuando ocurren múltiples cambios de reactivos y calibradores, brindando al laboratorio la capacidad de detectar cambios que pudieran suceder con nuevos reactivos o calibradores.

13 * Controles de tercera opinión en bancos de sangre. Alba Cecilia Garzón

14 Controles de tercera opinión en bancos de sangre. Alba Cecilia Garzón

15 tendencia Pérdida gradual de la confiabilidad del sistema de análisis. Pueden deberse: – Deterioro de la fuente de Luz del instrumento. – Acumulación gradual de desechos en la tubería de muestra. – Envejecimiento de los reactivos. – Deterioro gradual de la temperatura de incubación

16 Límite de cuantificación: Es aquel valor de concentración mínimo que puede obtenerse con una imprecisión aceptable. Límite de detección: Concentración mínima de un analito en la matriz de una muestra que puede ser detectada, pero no necesariamente cuantificada, bajo condiciones analíticas específicas. LINEALIDAD: La capacidad (dentro de un intervalo dado) para proporcionar resultados que son directamente proporcionales a la concentración del analito en las muestras de examen. El término linealidad aplicado a un método analítico, se refiere al tramo de concentraciones del analito en el que la respuesta del sistema de medición es una función lineal de la concentración; la representación gráfica de este tramo (concentraciones frente a respuestas) debe exhibir una buena correlación de los puntos experimentales a la recta de regresión para que el método analítico en cuestión sea aceptable

17 Veracidad: Grado de concordancia entre el valor medio de una serie grande de medidas y el valor del mensurando que se acepta como referencia. No puede tomar valores numéricos Sesgo (Bias): Expresión cuantitativa de la veracidad: diferencia entre el resultado esperado para el test y el valor aceptado como verdadero. En general, la desviación/diferencia se estima en medidas replicadas entre un método aceptado (definitivo, referencia, o diseñado para comparación) y el método evaluado, y se expresa en las unidades de la medida o en porcentaje. Refleja el error total sistemático [ISO 3534: 3.13]

18 El protocolo de una técnica debe contener: Fundamento de la técnica Tipos de muestras, obtención y conservación Equipos y reactivos requeridos Métodos de calibración de los aparatos Temperatura Linealidad, límite de detección, error sistemático, sensibilidad, especificidad. Pasos a seguir en la realización Control de calidad Interferencias Cálculo de resultados. Intervalos de normalidad Interpretación de la prueba Bioseguridad y eliminación de residuos.

19 PRECISION Grado de dispersión o concordancia entre una serie de resultados hallados sobre la misma muestra y con el mismo método en el mismo día o en días distintos. No se cambia ningún factor externo, misma técnica, mismo operador, mismas condiciones de trabajo. El valor estadístico que define la precisión es la desviación típica Sx o el CV (desviación estándar relativa a la media) CCI

20 La imprecisión Se debe a errores aleatorios (los resultados caen a ambos lados de la media) que afectan a la reproducibilidad de la medición. A mayor imprecisión mayor variabilidad de resultados, mayor dispersión. Cuando se comparan dos métodos puede considerarse más preciso el que tenga menor desviación estándar.

21 Algunos aspectos que producen imprecisión son : INTRAENSAYO: errores en el pipeteo, evaporación de la muestra, error espectrométrico, variación en la temperatura, variación electrónica posterior a la calibración INTERENSAYO: error aleatorio en la calibración, deterioro de los calibradores, fatiga del personal INTERDIA: variaciones en el lote del calibrador, errores de reconstitución, error en la calibración, cambio de lote. Los errores aleatorios se relacionan con el ámbito general del laboratorio

22 EXACTITUD Grado de concordancia o discrepancia entre un resultado y el valor real que se debería haber obtenido. Es decir, comparar dos resultados, el hallado en el laboratorio y el que realmente tiene la muestra. Para este último se emplea el método de referencia y el laboratorio de referencia. El valor estadístico que define la exactitud es la media aritmética. Las fuentes de inexactitud se relacionan con la calibración. CCE

23 La existencia de una inexactitud constante se denomina sesgo y se debe a motivos sistemáticos (baño mal termostatado, mala utilización micropipeta, longitud de onda mal seleccionada...)

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25 Niveles de decisión médica Son concentraciones de un analito dado, en las que los resultados son más críticamente interpretados por los médicos para efectuar un diagnóstico, un seguimiento o tomar decisiones terapéuticas. StatlandBE. Clinical Decision Levelsf orLaboratory Tests, Second Edition [OradellNJ; Medica lEconomics Books, 1987.] 96

26 Niveles de decisión médica 5.6 Aseguramiento de la calidad de los resultados de análisis. – 5.6.2.2 Materiales de control de la calidad NOTA 1: El laboratorio debe seleccionar las concentraciones de los materiales de control, cuando esto sea posible, especialmente iguales o cercanas a los valores de decision clínica, que aseguran la validez de las decisions tomadas.

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28 Materiales de referencia Calibrador, Patrón o Suero estándar. Hallo factor de calibración (FC). Se halla la concentración de las muestras. [ ] de la muestra = FC X absorbancia de la muestra. Sueros control I y II Verifico y controlo el proceso Obtengo resultados confiables.

29 Procesos analíticos Tipos de procesos analíticos – Proceso por lotes – Ej.: métodos manuales, analizadores de un canal. Procesos simultáneos de lotes – Ej.: analizadores multicanal Procesos de acceso aleatorio. – Ej.: analizadores automáticos

30 Interferencia: Es el efecto que produce un componente en la exactitud de la medición del analito. Los efectos de los interferentes potenciales deben ser estudiados y observar si afecta al rendimiento del análisis.

31 INTERFERENCIAS ANALÍTICAS Definición: Es el error sistemático producido por una sustancia distinta de la que se pretende medir en un procedimiento analítico. La cantidad de la interferencia depende de la concentración de la sustancia interferente y del método utilizado. El paciente sólo debe realizarse estudios complementarios de detección de interferencias en aquellos casos en que se diera modificaciones apreciables en un procedimiento de medida. cuando se considerase que la información del fabricante sea insuficiente.

32 CRITERIOS DE CALIDAD ANALÍTICA Evaluación de los efectos del desempeño analítico en las consecuencias clínicas en estados clínicos específicos. Difícil aplicación Establecer para cada situación clínica en particular.

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34 Variabilidad biológica (VB) VB intraindividual (CV i)VB interindividual (CV e)

35 fenómeno por el que los valores de una misma magnitud biológica de los individuos pueden variar en el curso del tiempo, en más de un individuo. Variación biológica interindividual: fenómeno por el que los valores de las magnitudes biológicas de un individuo pueden variar en el curso del tiempo. Variación biológica intraindividual:

36 Permite la validación de los resultados analíticos. Las técnicas varían según el tipo de análisis. Mediante este se pueden identificar y corregir los errores analíticos aleatorios (precisión) o sistemáticos (veracidad).

37 Curva de calibración Expresión de relación entre una indicación y un valor medido correspondiente. Ley de beer – lamber: la [ ] es directamente proporcional a la absorbancia. Límite de detección 0,25 mg/dL Límite de linealidad [ ] 500 mg/dL

38 Calibración por curva-Calibración por grafica analítica Se preparan varias soluciones estándares que contienen concentraciones conocidas del analito, dichas soluciones deben cubrir el intervalo de concentraciones de interés Así como tener una composición matriz, tan parecida como se pueda a la de las soluciones de la muestra Si se obtiene una grafica no lineal, como ocurre con frecuencia, puede usarse equipo electrónico o programas computacionales para compensar la curvatura y producir una salida que sea una función lineal de la concentración. En regiones no lineales el numero de soluciones estándares analizadas debe aumentarse para obtener la exactitud del análisis de las muestras problema

39 Condiciones de precisión Intermedia – Se obtienen los resultados con el mismo método y sistema de medida pero en condiciones operacionales distintas que pueden referirse a tiempo, calibración, operador y equipo. Especificar los elementos que cambian: “inter-ensayo”, “intra-dia”, “interdía”, “intra-laboratorio”… Condiciones de Repetibilidad – Condiciones en que se obtienen resultados independientes con el mismo método, en materiales idénticos, en el mismo laboratorio, por el mismo operador y con el mismo equipamiento durante un corto periodo de tiempo (ISO 3534-1); (precisión intra-ensayo). Condiciones de Reproducibilidad – Se obtienen resultados del mismo test con el mismo método en diferentes laboratorios con diferentes operadores y diferentes equipos (ISO 5725-1).

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41 Error aleatorio Son impredecibles, inherentes a toda medición, pueden ser ocasionados por factores como: fluctuaciones en la temperatura y energía eléctrica, variación entre técnicos en las mediciones, material mal lavado, agitación incorrecta, etc. Afectan a la PRECISION Se detectan a través de un CCI

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43 Intraensayo (mal pipeteo, variaciones de temperatura, inestabilidad del aparato, fallo en el tiempo de reacción); interensayo intradía (relevo de personal, reactivos incorrectos, desajuste del aparato); interensayo interdía (cambio de casa comercial, cambio de personal, deterioro del aparataje). Vienen de finidos por la imprecisión.

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45 Error sistemático Se presentan de manera continua y definida Estos errores incluyen instrumentales, personales, errores de aplicación y se pueden corregir con calibración. Afectan a la EXACTITUD Se detectan a través de un CCI y CCE

46 Error sistemático 1.El Error Sistemático se manifiesta como un cambio en la media de los valores de control. Afecta de igual manera todas las muestras. 2.Puede ser gradual (Tendencia) o abrupto(Desplazamiento).

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51 Verificación de métodos