CITOGENÉTICA CONVENCIONAL EN LÍQUIDO AMNIÓTICO APLICADA AL DIAGNÓSTICO PRENATAL Dra. Karen Falcones Gracia MIR 1 Hospital Virgen de los Lirios.

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1 CITOGENÉTICA CONVENCIONAL EN LÍQUIDO AMNIÓTICO APLICADA AL DIAGNÓSTICO PRENATAL
Dra. Karen Falcones Gracia MIR 1 Hospital Virgen de los Lirios

2 Introducción Es el área de la genética que se dedica al estudio de los cromosomas, su estructura, función, herencia y las enfermedades relacionadas con ellos. Utilizada en el estudio de anomalías cromosómicas en etapas prenatales y postnatales. En la etapa prenatal: Protocolos de Diagnóstico Prenatal En la etapa postnatal: Frente a una enfermedad de origen cromosómico.

3 Historia Años 50. Tjio y Levan en 1956, desarrollaron las técnicas de análisis cromosómico y determinaron que el número normal de cromosomas era 46. En los años 70 los estudios citogenéticos contaban los cromosomas en un solo color al microscopio, sobre un fondo blanco. Más adelante se descubrió como la tripsina digería los cromosomas y se podían estudiar bandas en ellos.

4 El uso de colchicina permitió su visualización en la etapa de metafases.
En los años 90 las técnicas de citogenética molecular (FISH, QF-PCR, ARRAY). Siendo de utilidad en aquellos casos en los que la alteración cromosómica es más pequeña que la propia resolución del cariotipo. La citogenética en líquido amniótico se realiza en laboratorios especializados

5 Aplicaciones al Dx Prenatal
Definición: “Diagnóstico Prenatal”: todas las acciones diagnósticas que tienen por objeto la identificación de un defecto congénito en el feto durante el embarazo. Conseguirá detectar la presencia de una anomalía congénita con la mayor celeridad posible.

6 Situación actual: Según la SEGO el 3% de los nacidos vivos presentan algún tipo de anomalía Enfermedades monogénicas. Enfermedades multifactoriales (unión de factores genéticos y ambientales). Malformaciones por agentes teratógenos y Anomalías cromosómicas El sistema europeo de vigilancia de anomalías congénitas estima la presencia de éstas anomalías en alrededor de 45 casos cada nacimientos. Las trisomías más prevalentes, la 21, 18 y 13 están estimadas en 23 casos, 6 casos y 2 casos.

7 Selección de la población y estrategias de cribado prenatal:
El primer trimestre de gestación para iniciar el control adecuado en este periodo. Estos grupos serán: Gestantes con antecedentes familiares de enfermedades hereditarias. Gestación previa con alguna malformación o cromosomopatía diagnosticada. Progenitor/es portador/es de alguna anomalía cromosómica. Cribado de las alteraciones congénitas prenatales Edad materna. Marcadores fenotípicos ecográficos. Marcadores bioquímicos en la sangre materna.

8 Marcadores ecográficos:
El más importante es la translucencia nucal. Su incremento medido entre la semana se correlaciona con aneuploidías principalmente con trisomía 21. Otros marcadores ecográficos incluyen la ausencia del hueso nasal, índice de pulsatilidad del ductus. Marcadores bioquímicos: son proteínas medidas en sangre materna cuyo o se correlaciona con la presencia de trisomía 21.

9 Los marcadores utilizados en el 1er trimestre son:
fβHCG, elevada en la trisomía 21. Proteína plasmática A asociada al embarazo (PAPP-A), disminuida en la trisomía 21. Los marcadores utilizados en el 2do trimestre son: Alfafetoproteína (AFP), disminuida en la trisomía 21. βHCGlibre (fβHCG) elevada en la trisomía 21. Estriol no conjugado (uE3), disminuido en la trisomía 21. Inhibina A, elevada en la trisomía 21.

10 Existen diferentes estrategias de cribado en función del momento de la gestación y el uso de los diferentes marcadores. La SEGO recomienda utilizar el cribado combinado de primer trimestre, realizado en un solo tiempo o en dos: En un solo tiempo: se realiza la valoración ecográfica y bioquímica el mismo día, alrededor de la semana 12. En dos tiempos se realizan las determinaciones bioquímicas en la semana 8-13 y ecográfica en la semana 11+0 y la 13+6.

11 El programa estadístico que calcula el riesgo incorpora otros factores de corrección como el peso materno, consumo de tabaco, etnia-raza, DM tipo II, etc. En caso de que la gestante se incorpore al programa de cribado entre la semana 14 y 17 de embarazo, que consiste en la realización de los test triple o cuádruple. El test triple utiliza como marcadores AFP, fβHCG y uE3. El test cuádruple utiliza como marcadores la AFP, fβHCG, uE3 e Inhibina A. puede considerarse la edad materna como criterio para la realización de la prueba invasiva.

12 Para el resto de alteraciones cromosómicas no se dispone de programas de cribado y son las ecografías durante el embarazo la forma de poder detectarlas La ecografía realizada alrededor de la semana 20 completa el programa de cribado y el hallazgo de una malformación en dicha ecografía, es indicación para realizar una técnica invasiva.

13 INDICACIONES DE LOS ESTUDIOS CITOGENÉTICOS
Cuando sospeche la presencia de una enfermedad debida a anormalidad cromosómica. La Asociación Europea de Citogenetistas (European Cytogeneticists Association, E.C.A) propone unas indicaciones claras para la realización de los estudios citogenéticos.

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15 Técnicas invasivas en el Dx prenatal
Las técnicas invasivas más empleadas son: La biopsia corial. La amniocentesis. La cordocentesis.

16 BIOPSIA CORIAL: Técnica invasiva para obtener una muestra de trofoblasto por vía transcervical o transabdominal. Es la técnica de elección para el estudio del cariotipo antes de la semana 15 de gestación. La biopsia corial proporciona resultados más tempranos que la amniocentesis.

17 Una fuente de error diagnóstico, encontrado en las biopsias de vellosidad corial, es la existencia de un mosaicismo confinado a la placenta. Cuando se diagnostique un mosaicismo en el estudio de vellosidad corial debe ofrecerse una amniocentesis que informará del cariotipo real del feto. El principal riesgo que presenta es la pérdida fetal que supone hasta un 1%. Otros riesgos asociados a su práctica son la infección aguda 0.5% y la pérdida hemática que suele ser escasa.

18 AMNIOCENTESIS: Es un procedimiento invasivo de diagnóstico prenatal del segundo trimestre del embarazo. Fue descrita por primera vez por Steele y Berg en Consiste en la introducción de una aguja espinal a través de la pared abdominal, la pared uterina y la cavidad amniótica guiada ecográficamente para la obtención de una muestra de líquido amniótico (LA) mediante aspiración.

19 Se realiza a partir de la semana 15-16 de gestación.
Contiene células de origen fetal. Ofrece una gran fiabilidad diagnóstica basada en la amplia experiencia que los laboratorios de genética poseen en el manejo de LA. Por otra parte, se obtienen cariotipos de mayor calidad y por tanto de más fácil interpretación. Los fracasos de cultivos celulares se describen por debajo del 1%. La tasa de mosaicismos es del 0.25%, menor que para la biopsia corial.

20 CORDOCENTESIS: Obtención de sangre fetal mediante punción del cordón umbilical. Nunca se debe realizar antes de la semana 18 de gestación. Presenta mayor complejidad técnica frente a la biopsia corial y amniocentesis. Se realiza cuando se establece una sospecha de cromosomopatía tardíamente o para resolver dudas diagnósticas generadas tras una biopsia corial o amniocentesis.

21 También resulta útil para estudiar trastornos hematológicos fetales (anemias, trombopenias).
La tasa de pérdidas fetales oscila entre el 1% y el 3%. Es muy frecuente la hemorragia en la zona de punción (>80%) y la bradicardia fetal. Otras complicaciones, aunque poco frecuentes, son trombosis del vaso puncionado, infección y abruptio placentae.

22 TÉCNICAS DE CULTIVO DEL LÍQUIDO AMNIÓTICO
Se utilizan distintas clases de tejidos humanos. La elección del tejido depende Del paciente (prenatal o postnatal), La finalidad del diagnóstico (constitucional o adquirido) Las indicaciones clínicas. En el diagnóstico prenatal se utiliza líquido amniótico, vellosidad corial y sangre fetal.

23 Encontramos amniocitos, células epiteliales y fibroblastos.
En el LA están presentes distintos tipos celulares, en pequeñas cantidades, por lo que es necesario cultivarlas para obtener la cantidad suficiente para poder estudiarlas. Encontramos amniocitos, células epiteliales y fibroblastos. Los amniocitos en condiciones de cultivo apropiadas, se adhieren a la superficie del frasco de cultivo y crecen como una monocapa. El estudio de los cromosomas y la elaboración del cariotipo necesitan la presencia de células en división sobre todo en metafase.

24 Cultivo del líquido amniótico:
El espécimen de LA debe llegar lo antes posible al laboratorio. El volumen recomendable de LA es de 15 a 30 ml. Todo el proceso debe hacerse en condiciones estériles y con material esterilizado. Previamente a la siembra el LA se centrifuga para utilizar únicamente el botón celular. Se debe sembrar en cabinas de flujo laminar y en frascos estériles.

25 Para disminuir las pérdidas de los cultivos por fallos del incubador las guías indican la realización de los cultivos por duplicado, siembras independientes y conservación de los cultivos en estufas distintas. Se utilizan medios de cultivo acuosos que contienen una solución salina en un sistema tamponado, para conservar el pH entre Se mantendrán 37ºC y con atmósfera del 5% de CO2, con los tapones sin cerrar para permitir el intercambio gaseoso.

26 A partir del 9-10 días de cultivo se evalúa el crecimiento de las colonias de células en el fondo del frasco mediante visualización al microscopio de luz invertida. Suficiente crecimiento celular se realiza un subcultivo de este frasco. Consiste en despegar y resembrar las células del frasco crecido en otros dos frascos de cultivo para permitir que las células sigan dividiéndose y, así conseguir un mayor índice mitótico y por tanto mayor número de metafases. Para despegar las células del fondo del frasco se utiliza tripsina.

27 Cuando el crecimiento y el índice mitótico es el adecuado (24-48h) se procede a recolectar las células para la preparación de extensiones, la cual se realiza mediante la adición al medio de colchicina. Las células recolectadas se someten a un choque hipotónico con una solución hipotónica. Por un fenómeno de osmosis esta solución penetra en el interior de las células provocando que estas se hinchen. Tras el choque hipotónico se realizan una serie de fijaciones con una solución fijadora (Carnoy) para detener la acción del cloruro y fijar las células.

28 Finalmente, la suspensión celular fijada se extiende aspirando con una pipeta pasteur y dejando caer un par de gotas sobre un portaobjetos. Mediante esta maniobra conseguimos que las células se rompan y los cromosomas se expandan, permitiendo su posterior bandeo. En el momento de realizar las extensiones es muy importante ajustar las condiciones de temperatura y humedad porque son dos factores que influyen mucho en la obtención de buenas preparaciones.

29 Métodos de identificación Cromosómica
Bandas G: bandeo GTG. Es la técnica más usada en los laboratorios de citogenética. Bandas NOR: mediante nitrato de plata se tiñen las regiones organizadoras del nucleolo localizadas en los tallos y los satélites de los cromosomas acrocéntricos. Bandas C: tinción específica de región centromérica y heterocromatina constitutiva mediante hidróxido de bario. Bandeo de alta resolución: tinción con giemsa en etapas más precoces de la mitosis (prometafase) consiguiendo un nivel más elevado de resolución.

30 Análisis Citogenético:
Introducción: El genoma por 46 cromosomas distribuidos en 23 pares. De estos, 22 pares son similares en el hombre y la mujer, y se denominan AUTOSOMAS. El par restante, está formado por los cromosomas sexuales o GONOSOMAS, dos cromosomas X en las mujeres y un cromosoma X y otro Y en los hombres. Los cromosomas del mismo par se denominan cromosomas HOMÓLOGOS, cada uno de los cuales procede de un progenitor.

31 Captura de metafases: Hay que tener en cuenta para ello:
El grado de solapamiento entre cromosomas. La calidad del bandeado. Hallazgo de metafases completas o incompletas.

32 Cariotipado: Se realiza la separación correcta de los cromosomas y se ordenan por parejas de cromosomas homólogos en base a su morfología, tamaño y posición del centrómero.  El cromosoma metafásico está formado por dos cromátides unidas por un centrómero que los divide en dos brazos, el brazo corto (denominado con la letra p) y el brazo largo (denominado con la letra q). 

33 Según la posición del centrómero, los cromosomas humanos se clasifican en: 
METACÉNTRICOS: centrómero en el centro, es decir, los brazos son aproximadamente de la misma longitud.  SUBMETACÉNTRICOS: centrómero desplazado del centro. Los brazos difieren en longitud.  ACROCÉNTRICOS: centrómero situado cercano a un extremo. Brazo largo muy grande y corto muy pequeño. 

34 Análisis: Para la obtención de un informe fiable es preciso capturar veinte metafases y cariotipar cinco de ellas. Se deben analizar exhaustivamente las bandas de cada cromosoma comparándolas con las de su homólogo. Para ello, puede ser útil la ayuda de un “mapa cromosómico” o idiograma: Representación esquemática del tamaño, forma y patrones de banda específicos de cada cromosoma.  

35 Anomalías cromosómicas en el Dx Prenatal
Anomalías en el número de cromosomas: Aneuplodías Poliploidías. Anomalías en la estructura de los cromosomas. Reordenamiento equilibrado Reordenamiento desequilibrado.

36 Anomalías en el número de cromosomas:
Aneuploidia  Es el trastorno cromosómico humano más común y el de mayor importancia clínica, teniendo lugar en al menos el 5% de las gestaciones. Se caracteriza por presentar un número de cromosomas anormal, debido a un exceso (trisomía) o a un defecto (monosomía), producido por un error en la separación de cromosomas que experimentan las células sexuales para la formación de espermatozoides y óvulos durante la meiosis. 

37 Las trisomías de todo un autosoma suelen ser letales y terminan en abortos, salvo las que implican a los cromosomas 21, 13 y 18, que pueden llegar a término, dando lugar a los Síndromes de Down, Patau y Edwards, respectivamente. Las trisomías que afectan a los gonosomas suelen producir menos clínica, pasando en ocasiones desapercibidas (Síndrome XYY, Klinefelter, triple X)  Las monosomías son, casi siempre, incompatibles con la vida, con la excepción de la que afecta al cromosoma X, Síndrome de Turner. 

38 Poliploidia  Se producen cuando aparece un múltiplo exacto del número haploide de cromosomas, triploidía (3n) o tetraploidía (4n). Se observan con frecuencia en tejido abortivo y tumoral, siendo excepcional en recién nacidos.  

39 Anomalías de la estructura de los cromosomas
Pueden ser equilibradas o desequilibradas. Reordenamientos equilibrados: está presente todo el material cromosómico, aunque organizado de manera diferente. No tienen efectos fenotípicos, pero pueden suponer un riesgo para la descendencia. Pueden ser los siguientes:  Translocación recíproca: intercambio de segmentos entre cromosomas no homólogos.  Inversión: producida por dos roturas en un cromosoma, el segmento gira 180º y se vuelve a reconstituir.  Inserción: cuando un segmento se desprende de un cromosoma y se inserta en otro. 

40 Reordenamientos desequilibrados: en estos casos, existe pérdida o ganancia de material genético, por ello, suelen acompañarse de efectos fenotípicos.  Deleción: pérdida de un fragmento cromosómico que genera un desequilibrio.  Duplicación: repetición de un fragmento de un cromosoma a continuación del fragmento original.  Isocromosoma: cromosoma al cual le falta un brazo y el otro se ha duplicado.  Cromosoma en anillo: se producen por dos roturas terminales y unión de los extremos. 

41 Dificultades diagnósticas en el diagnóstico prenatal
Con cierta frecuencia se obtienen resultados de difícil interpretación:  Mosaicos: presencia de dos o más líneas celulares diferentes en un mismo individuo.   Cromosomas marcadores: cromosoma extra con una estructura anormal, tienen un tamaño igual o inferior al cromosoma 20 y no pueden ser identificados con las técnicas de citogenética convencional.  Heteromorfismos: variaciones de tamaño, morfología o patrón de bandas que no se acompañan de efectos clínicamente relevantes. 

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43 INFORME CITOGENÉTICO  Su cometido es ofrecer una descripción del resultado de manera clara, sin ambigüedades, para que sea fácilmente comprensible por personal no especializado. 

44 Debe incluir la siguiente información:
Identificación del laboratorio que realiza el estudio y del paciente. Tipo de tejido analizado. Fecha de recepción del espécimen y de emisión del informe. Datos del peticionario. Indicación diagnóstica. Resolución del bandeo cromosómico. Fórmula cromosómica con nomenclatura ISCN. Conclusión diagnóstica. Limitaciones propias de la técnica. Nombre y firma del facultativo que emite el informe. 

45 El informe de un resultado ANORMAL debe incluir la siguiente información adicional:
Descripción de la anomalía de manera escrita y fórmula cromosómica con nomenclatura ISCN (tanto alteraciones equilibradas como desequilibradas). Nombre del Síndrome o enfermedad asociado, número de células analizadas. En el caso de la existencia de más de una línea celular, especificar el número analizado en cada línea. 

46 TÉCNICAS DE CITOGENÉTICA MOLECULAR
El FISH (Hibridación in situ fluorescente) mediante sondas fluorescentes de DNA y la QF-PCR (Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa fluorescente) a través del uso de microsatélites. Se utilizan para detectar de forma rápida, sin la necesidad de realizar un cultivo, las aneuploidías prenatales más frecuentes. 

47 Array-CGH: También llamado cariotipo molecular.
Es un sistema de análisis global del genoma basado en la hibridación genómica comparada. El genoma de la muestra se compara con un genoma de referencia (“normal”) detectando ganancias o pérdidas de material genético que con la citogenética convencional pasarían desapercibidas. Presenta algunas limitaciones ya que no detecta reordenamientos equilibrados, mosaicos de baja frecuencia y poliploidías.

48 Análisis de DNA fetal libre en sangre materna:
Se trata de una prueba de cribado prenatal no invasiva que permite la detección de las principales aneuploidías fetales mediante técnicas de secuenciación masiva aplicadas al DNA fetal liberado a la sangre materna.  Por tanto, la citogenética convencional y la molecular, no deben ser técnicas excluyentes, sino COMPLEMENTARIAS. 

49 GRACIAS