MÉTODOS DE SEPARACIÓN QFB.EBC. DAVID GUSTAVO GARCÍA GUTIÉRREZ 1.

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1 MÉTODOS DE SEPARACIÓN QFB.EBC. DAVID GUSTAVO GARCÍA GUTIÉRREZ 1

2 Generalidades 2  Separar componentes de una muestra (mezcla)  Previos a la determinación  Análisis cualitativo y cuantitativo  Cromatografía de gases  Cromatografía de líquidos de alta eficacia  Cromatografía de fluidos supercríticos  Electroforesis

3 Generalidades 3  Métodos para el análisis química  Selectividad  Especificidad  Separación del analito de posibles interferencias

4 Métodos clásicos 4 Hasta mediados del siglo XX  Precipitación  Destilación  Extracción En la actualidad  Cromatografía  Electroforesis

5 Introducción a las separaciones cromatográficas 5

6 Definición 6 Método físico de separación en donde los componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una que permanece estacionaria y otra la atraviesa.

7 Historia de la cromatografía 7  Botánico Mikhail Tswett (Rusia), 1903.  Cromatografía (chroma-graphein) = Escritura a color  Separo pigmentos de extracto de hojas verdes: Utilizando éter de petróleo, un disolvente no polar. Una columna de vidrio Carbonato de calcio Utilizó como detector la simple observación.

8 Historia de la cromatografía 8  Finales de los 30 y principio de los 40 se desarrollo la técnica.  1952, Premio Nobel, por sus descubrimientos en este campo a:  A. J. P. Martin  R. L. M. Synge  Entre 1937 y 1972, doce premios Nobel

9 Descripción general 9 Proceso de separación que involucra la interacción de uno o más solutos y dos fases.  Fase móvil: Un gas, líquido o fluido supercrítico que pasa a través de una fase estacionaria con la que es inmiscible.  Fase estacionaria Un sólido o líquido el cual no se mueve fijandose a una columna o superficie solida.

10 Descripción general 10  La muestras se introduce en la fase móvil  Es transportada a lo largo de la columna-fase solida  Las especies de la muestra experimentan interacciones repetidas (repartos) entre ambas fases.  Componentes fuertemente retenidos  Componentes que se unen débilmente a la f. estacionaria  A consecuencia de la distinta movilidad  Los componentes se separan en bandas o zonas discretas  Estas pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente.

11 Clasificación 11 1. La forma en que se ponen en contacto las fases  Cromatografía en columna  Cromatografía en plano 2. Tipo de fases  Cromatografía de líquidos  Cromatografía de gases  Cromatografía de fluidos supercríticos

12 Clasificación por mecanismo de separación: 12  C. de reparto: separa los solutos basándose en la solubilidad.  C. de adsorción: se basa en la afinidad de adsorción.  C. de exclusión: separa solutos según el peso molecular.  C. de intercambio iónico: separa solutos según la carga iónica.

13 Clasificación por la fase móvil 13  C. de gases: la fase móvil es un gas y pueden ser dos sistemas:  C. gas-liquido  C. gas-sólido  C. líquida: la fase móvil es un liquido y puede ser:  C. liquido-liquido  C. liquido-sólido  C. de exclusión  C. de intercambio iónico Las sustancias que no pueden ser examinadas son las insolubles y aquellas que se descomponen con el solvente o con la fase estacionaria.

14 Clasificación 14

15 Teorías 15 El proceso cromatográfico - unión de fenómenos tales como:  Hidrodinámica,  Cinética,  Termodinámica,  Química de superficie  Difusión. Para explicar el comportamiento de los solutos en las columnas:  Teoría de los Platos Teóricos (Martin & Synge).  Teoría Cinética (Van Deemter, Zuiderweg, Klinkenberg & Sjenitzer).  Teoría Desarrollada para Columnas Capilares (Golay).

16 Cromatografía de elución en columna 16  Se introduce en la columna la muestra (t 0 ).  La introducción de fase móvil hace que la muestra avance  Tienen lugar el reparto entre la f. móvil y las porciones de f. estacionaria (t 1 ).  Las adiciones de la fase móvil hacen avanzar las moléculas de soluto en una serie de continuas transferencias entre las fases estacionaria y móvil.

17 Cromatografía en columna 17  La velocidad media a la que migra el soluto depende de la fracción de tiempo que reside en la f. movil  Las diferencias de velocidad hacen que se separen los componentes de la mezcla (t 2 ).  El aislamiento de las especies se realiza haciendo pasar suficiente fase móvil hasta que las bandas individuales salen de ella (t 3 y t 4 ).

18 18

19 Cromatografía en columna 19  Análisis cualitativo  Tiempo de retención  Posición en la fase estacionaria tras el periodo de elución.  No aporta mucha información químicas  Buen método para evidenciar ausencia de compuestos.  Información cuantitativa  Comparación de altura o área del pico con patrones. Mediante el método de calibrado y patrones, El método del patrón interno, y El método de la normalización de las áreas.

20 Cromatografía en columna 20  Durante la elución ocurre la dilución del analito  Se produce una importante dilución de los analitos (su concentración disminuye) mientras están siendo separados.  El avance por la columna aumenta la distancia entre las bandas  Hay un ensanchamiento de ambas bandas

21 Cromatografía de elución en columna 21

22 Extracción liquido - liquido 22  Es el reparto preferencial entre dos fases inmiscibles: F ac y F org, K = ________ n t = n org + n ac p + q = 1

23 Distribución binomial 23 # TUBO Transfer. 01234 01 1pq 2q22pqp2 3q33pq23p2qp3 4q44pq36p2q24p3qq4

24 Ejemplo 1 24 1. Verificar la cantidad de cada soluto en el tubo 1 después de dos transferencias con coeficientes de distribución:  K A = 4  K B = 1

25 Ejemplo 2 25 Se considera para el inicio de una extracción múltiple 1 mmol de A y 1 mmol de B, después de 5 transferencias se vacía el contenido de los tubos 0, 1, 2 en un frasco así como el contenido 4 y 5 en otro.  Calcule el contenido de A y B en cada uno de los frascos

26 Equilibrios 26 3.12 12.5 18.75 12.5 3.12

27 Terminología 27 Absorción:  La retención de una especie química por parte de una masa y depende de la tendencia que tiene ésta a formar mezcla o a reaccionar químicamente con la misma. Adsorbente: fase estacionaria en la C. de adsorción y de reparto. Adsorción:  Es la retención de una especie química en los sitios activos de la superficie de un sólido, quedando limitado el fenómeno a la superficie que separa las fases o superficie interfacial, esta retención superficial puede ser física o química. C. en fase inversa: C. con una fase estacionaria no polar y una fase móvil polar. C. en fase normal: C. con una fase estacionaria polar y una fase móvil no polar.

28 Terminología 28 Disolvente : Cualquier fase móvil. Elución: Proceso de extraer un soluto de la fase estacionaria. Eluyente: La fase móvil una vez que se extrae de la columna. Fase estacionaria:  Material que permanece dentro de la columna cromatográfica durante la cromatografía y que retiene algún componente de la muestra, posee una gran área superficial y puede ser un sólido o un líquido dispuesto sobre un sólido que actúa como soporte.

29 Terminología 29 Fase móvil:  Es un fluido que puede ser líquido, gas o fluido supercrítico que se usa como portador de la mezcla y que se hace pasar a través de la columna cromatográfica y la fase estacionaria. Origen: Lugar físico donde se coloca la muestra al principio. Soporte:  El material sólido inerte que en la C. de reparto sirve para sostener la fase estacionaria líquida en su sitio. Sorbente: Cualquier fase estacionaria.

30 Parámetros cromatograficos 30  Pico de aire  Línea base  Altura de pico (h)  Anchura del pico w (4  )  Área del pico

31 Terminología 31 Cromatograma:  Si colocamos un detector al final de la columna que responde a la concentración del soluto y se registra su señal en función del tiempo (o del volumen de fase móvil añadido) se obtiene una serie de picos que representan un grafico denominado cromatograma.  Grafico útil para el análisis cualitativo y/o cuantitativo.  La posición de los picos en el eje del tiempo puede servir para identificar los componentes de la muestra  Las áreas bajo los picos proporcionan una medida cuantitativa de la cantidad de cada componente.

32 Terminología 32 Tiempo de retención:  Es el tiempo que transcurre después de la inyección de la muestra hasta que el pico de concentración del analito alcanza el detector;  Es el tiempo que tarda un compuesto en salir de la columna;  Es el tiempo que tarda en aparecer el máximo de un pico,  Se representa con el símbolo t R.

33 Volumen y tiempo de retención 33  Volumen de retención, V R : Volumen de fase móvil requerida para eluir un soluto de la columna  Tiempo de retención, t R : Tiempo requerido para cada componente para recorrer toda la columna.

34 Volumen y tiempo de retención 34 V R = t R · flujo t Rb t Ra tiempo A B señal

35 Terminología 35 Tiempo muerto t M :  Es el tiempo necesario para que la especie no retenida alcance el detector;  Es el tiempo de migración de la especie no retenida;  Es el tiempo necesario para que, por termino medio, una molécula de la fase móvil pase a través de la columna

36 Terminología 36

37 Terminología 37  La velocidad lineal promedio de migración del soluto es:

38 Terminología 38 Velocidad lineal promedio u del movimiento de las moléculas de la fase móvil es:

39 Plato teórico  Sistema “ESTATICO” en equilibrio  Cada especie presenta un equilibrio entre la fase móvil y la fase estacionaria

40 Terminología 40 Constante de distribución:  Los equilibrios de distribución suponen la transferencia de una analito entre las fases. A móvil ⇔ A estacionaria  La constante de equilibrio para este proceso se denomina:  Constante de distribución  Razón de distribución o  Coeficiente de distribución  Mide la distribución del analito entre la fase estacionaria y la fase móvil.  C S es la concentración molar del soluto en la fase estacionaria (mol/L)  C M es la concentración molar en la fase móvil (mol/L)

41 Coeficiente de reparto 41  K es independiente de la concentración. Puede afectarse por factores como la temperatura. Cuando K se incrementa el soluto tarda más tiempo en pasar a través del sistema

42 Factores que influyen en la separación 42  Valores de K suficientemente diferentes.  Tener el suficiente # de equilibrios  Eficiencia en la columna:  t R mas cortos  Picos mas angostos

43 Coeficiente de reparto  f es la fracción de tiempo que el soluto pasa en la fase móvil. Puesto que las fases estacionaria y móvil, tienen volúmenes conocidos; V e, V m. A partir de esto, se puede calcular el coeficiente de partición.

44 Coeficiente de reparto 44  Dividiendo entre: C M V M

45 Coeficiente de reparto  Como:

46 Coeficiente de reparto  Cuando se incrementa: V E : Se incrementa la retención. V M : Disminuye la retención.

47 Coeficiente de reparto  V E y V M, pueden alterarse cambiando el diámetro y la longitud de la columna  u y v, puede modificarse al variar el flujo.

48 Factor de capacidad 48  La razón de la cantidad de soluto en la fase estacionaria y la cantidad en la fase móvil.  Es característico de un compuesto especifico en una composición de fase móvil a una temperatura y en un tipo de columna

49 Factor de capacidad 49

50 Terminología 50 Factor de retención o factor de capacidad:  Describe la velocidad de migración de los solutos en la columna. Para una especie A, el factor de capacidad k’ A se define como:  k’ A es el coeficiente de distribución de la especie A,  V S es el volumen de la fase estacionaria y  V M es el volumen de la fase móvil.

51 Terminología 51 Factor de retención o factor de capacidad:  Medida de tiempo transcurrido en la f. estacionaria en relación con el tiempo transcurrido en f. móvil.  Es el tiempo adicional que una banda de soluto requiere para eluir, dividido entre el tiempo de elución de una banda no retenida (k’=0)  La relación establece cuantos volúmenes muertos (o tm) se necesitan para alcanzar a Vol. de retención (o tr)  Cuando el factor de capacidad es menor que la unidad, la elución es tan rápida que es difícil determinar con exactitud los tiempos de retención.  Cuando el factor es del orden de 10 o mayor, los tiempos de retención son excesivamente largos.

52 Factor de capacidad

53

54 Magnitudes corregidas 54  Tiempo de retención ajustado señal tiempo t0t0 0.0

55 Factor de selectividad 55  Medida de separación relativa entre dos picos  Medida de la interacción relativa de los solutos con la fase estacionaria

56 Terminología 56 Factor de selectividad:  El factor de selectividad α de una columna para dos especies:  KB es el coef. de distribución para la especie mas retenida  KA es el coeficiente para la menos retenida  Depende de la naturaleza de la fase estacionaria y móvil, y  La temperatura de operación de la columna

57 Factor de selectividad  Se puede evaluar la selectividad en base a los tiempos de retención para cada soluto.

58 Terminología 58 Resolución cromatográfica:  La resolución cromatográfica R S de una columna es una medida cuantitativa de su capacidad para separar dos analitos.  W A y W B son la anchura de los picos A y B.  Si R > 1.5 la separación de los componentes es completa  La resolución puede mejorarse alargando la columna, aumentando así el número de platos. Una consecuencia negativa es el incremento del tiempo requerido para la separación.

59 Resolución

60 60

61 Terminología 61 Eficiencia en cromatografía  La eficiencia se define en base a dos términos  1º La altura del plato H  2º El número de platos N.  La eficacia de la columna a mayor número de platos, y  A menor altura de plato.  Las eficacias en términos de número de platos varían de cientos a miles, y  Las alturas de plato de unas pocas décimas a milésima de centímetro.

62 Número de plato teórico 62  En extracción con disolvente, un plato es representado por cada equilibrio (extracción).  En una destilación fraccionada, un plato es representado por cada destilación.  En una columna cromatografíca se puede aplicar el concepto de plato teórico (cada evento de separación realizado).  Se puede estimar el número de platos teóricos en la columna basado en los tiempos de retención y ancho de las señales de cada compuesto.

63 Altura equivalente a un plato teórico 63  Longitud de columna en que se lleva a cabo una separación.

64 Equilibrios 64

65 Terminología 65 Número de platos N:

66 Terminología 66  Las bandas cromatográficas tienen una forma gaussiana,  Definir eficacia de una columna en términos de varianza por unidad de longitud.  La curva es gaussiana, y la ubicación de L -1 σ y L +1 σ se indica mediante líneas verticales discontinuas.

67 Número de plato teórico 67  Método de las tangentes.

68 Número de plato teórico 68

69

70 Resolución 70

71 71

72 Teoría de la separación n Como se lleva a cabo la separación. n Como son las señales analíticas. 72

73 Factor de Asimetría AF = b / a AF = 1 AF > 1 AF < 1 10% a b 73 Pico simétrico Pico coleado Pico cabeceado

74 Factor de asimetría 74 Cs CMCM

75 Asimetría de la banda 75  Si k’ es mayor a concentraciones mas bajas de soluto  La zona de baja concentración del pico eluye mas lentamente.  Por lo tanto la señal del pico será “coleada”  Combinación equivocada de muestra y empaque de columna  El tipo inverso de asimetría se conoce como “cabeceado”  k` es mayor a concentraciones mas altas de soluto. Solución : Disminuir el tamaño de la muestra hasta que las bandas sean simétricas y tR constantes.

76 Resolución 76  Ecuación fundamental de la resolución Donde k’ es un promedio entre k’ 2 y k’ 1 si k’ 2  k’ 1, entonces k’ = k’ 2

77 Eficiencia de la columna 77  Empleo de columnas mas largas incrementamos N  Trabajar con condiciones optimas de flujo y temp.  k incrementa disminuyendo la temperatura  Alfa se aumenta:  Sustituyendo la fase estacionaria.

78 Variables cinéticas 78 VariableSímboloUnidades Vel. Lineal de la fase móvilucm/s Coeficiente de difusión en la fase móvilDmcm 2 /s Coeficiente de difusión en la fase estacionariaDscm 2 /s Factor de retenciónk’- Diámetro de la partícula de rellenodpcm Espesor del recubrimiento liquido en la fase estacionariadfcm

79 Variables cinéticas 79  Efecto del caudal de la fase móvil sobre la altura de plato. Gas/Liq (-1) v = cm/s H = mm

80 Variables cinéticas 80  Efecto del caudal de la fase móvil sobre la altura de plato. Gas/Liq (-1)  Velocidades lineales menores en líquidos.  Las separaciones cromatograficas en gases son en menor tiempo  Las alturas de plato son por lo menos un orden de magnitud menor en líquidos.  Columnas  En líquidos 25 a 50 cm (caída de presión)  En gases 50 m o más

81 Teoría Cinética 81 J.J. van Deemter, Zuiderweg, Klinkenberg y Sjenitzer: Dinámica de la separación. Ecuación de van Deemter

82 Difusión de Eddy 82 Termino del camino libre Difusión en remolino Difusión parasita

83 Difusión parásita 83 N v A : Constante del empaque dada por la calidad del relleno d p : diametro de la partícula H = cm

84 Difusión longitudinal 84

85 Difusión longitudinal 85 N v B/v A  : Cte. del empaque, factor de obstrucción. Columnas rellenas = 0.6 Columnas capilares = 1 D M : Difusión de soluto en la f. móvil Velocidad de migración por gradiente H = cm

86 Resistencia a la transferencia de masa 86

87 Transferencia de masa 87 N v Cv B/v A d f : Grosor de la fase estacionaria. D E : Coef. de difusión del soluto en la fase estacionaria H = cm

88 Efecto global 88 N H óptimo v Vel. lineal óptima Cu B/u A Global v = cm/s H = cm

89 Teoría Cinética 89 J.J. van Deemter, Zuiderweg, Klinkenberg y Sjenitzer: Dinámica de la separación

90 Análisis cualitativo y cuantitativo 90  Cualitativo  Parámetros de retención  Detectores selectivos EM, FTIR, RMN, UV  Cuantitativo  Altura de pico  Área de pico Buena resolución Respuesta en el rango de linealidad del detector

91 Análisis cualitativo y cuantitativo 91  Análisis cuantitativo  ¿ Altura de pico o área de pico? El área debe utilizarse para picos con colas pronunciadas Ambos son imprecisos, con un volumen de inyección irreproducible. La altura de pico puede usarse si el ancho del pico de los compuestos es el mismo para estándares y muestra.

92 Análisis cuantitativo 92  Normalización de áreas  Normalización de áreas con factores de respuesta  Estándar externo  Estándar interno

93 Análisis cuantitativo 93  Normalización de área o altura de pico  Limitación: todos los componentes deben eluir.

94 Análisis cuantitativo 94  Normalización de área con factor de respuesta