BIOTRANSFORMACIONES ENZIMATICAS INDUSTRIALES

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1 BIOTRANSFORMACIONES ENZIMATICAS INDUSTRIALES
procesos químicos más ó menos complejos MAS VENTAJAS A NIVEL INDUSTRIAL... condiciones medioambientales muy suaves ( moléculas lábiles, centro de trabajo, medio ambiente) menos pasos de purificación (especificidad) menos subproductos MAS REQUISITOS... conversiones cuantitativas actividad y estabilidad del biocatalizador reduccion de inhibición por substratos y productos estereoespecificidad, regioselectividad total eliminación de reacciones laterales

2 + E SINTESIS TERMODINAMICAMENTE CONTROLADA DE ANTIBIOTICOS
Cefalotina Tienilacético 7 - ACA + E H + 3 N R ' O R - C - O H+ O R - C - OH DISOLVENTES Keq = [ RR’ ] [ H2O ] [ ROH ] [ R’NH2 ]

3 100 100 100 14 EFECTO DE CODISOLVENTES SOBRE DIFERENTES DERIVADOS
DE DIFERENTES ACILASAS ACTIVIDAD ESTABILIDAD EN 50% DMF 20 40 60 80 100 100 100 100 K.citrophila Actividad relativa (%) Actividad Residual (%) E. coli 14 E. coli 15 30 45 60 75 Hidrólisis. Penicilina G pH 8, 37ºC Síntesis. Penicilina G pH6,5 , 50% DMF, 4ºC Tiempo ( horas ) K. citrophila E.coli Acetato sódico 10 mM pH 5, 25ºC

4 [ codisolvente] = 50% RCOOH + H2NR´ RCONHR´ RCOO- + H+ RCOOH DMF
EFECTO DE LOS CODISOLVENTES SOBRE LOS RENDIMIENTOS DE STC PENICILINA G EFECTO DE LOS CODISOLVENTES SOBRE EL pK DE LOS ACIDOS CARBOXILICOS DMF Butanodiol RENDIMIENTO (%) Glicerina Tampón pH Acetonitrilo Acetona Dioxano DMF Metanol Butanodiol Etanol Glicerina Etilenglicol RCOOH + H2NR´ RCONHR´ [Sustratos] = 10 Mm , T= 4ºC [ codisolvente] = 50% RCOO- + H RCOOH

5 Rendimiento de Síntesis
EFECTO DE DIFERENTES CODISOLVENTES ORGANICOS EN EL pK DE LOS ACIDOS CARBOXILICOS Y RENDIMIENTOS DE SINTESIS DE PENICILINA G EN CONDICIONES STANDARD Codisolvente pK Rendimiento de Síntesis Tampón 50% Acetona 50% Dioxano 50% DMS 50% DMF 50% Celosolve 50% Tetraglime 4.2 5.35 5.5 5.8 5.4 2% 53% 55% 56% 50%

6 GENERACION DE MICROAMBIENTES ARTIFICIALES EN EL ENTORNO DE LA PROTEINA
Coinmovilización de polímeros hidrofílicos Modificación con polímeros hidrofílicos

7 EFECTO GLOBAL DE LA ESTABILIZACION DE PGA
100 90% tetraglime 80 60 70% tetraglime 55% dioxano Actividad Residual, (%) 40 20 50% dioxano 20 40 60 80 100 pH 6.5, 4ºC Tiempo, (horas)

8 Síntesis de Cefalotina
DISEÑO DEL CATALIZADOR DEL MEDIO DE REACCION FUENTE ENZIMATICA Productividad: 6Kg / l / día Estabilidad derivados: Actividad > 90% después de dos meses Hidrólisis inespecífica 7- ACA < 1%

9 DISEÑO DE BIOTRANSFORMACIONES ENZIMATICAS
SINTESIS CINETICAMENTE CONTROLADA DE ANTIBIOTICOS - LACTAMICOS CATALIZADA POR PENICILINA ACILASAS INMOVILIZADAS

10 Solubilidad / Estabilidad
DISEÑO DE BIOTRANSFORMACIONES Actividad Biocatalizador Estabilidad Solubilidad / Estabilidad Reactantes Toxicidad Medio Subproductos Rendimientos Derivados Medios de reacción Substrato Propiedades catalíticas: Enantioselectividad Regioselectividad Especificidad Inhibiciones

11 FLEXIBILIDAD ESTRUCTURA ENZIMATICA
pH / T / [ cosolvente ] Propiedades Catalíticas Subóptimas Selectividad x Especificidad x Optimas Selectividad y Especificidad y FLEXIBILIDAD ESTRUCTURA ENZIMATICA

12 Actividad / Estabilidad
PARAMETROS DE INTERES Actividad / Estabilidad Hidrólisis Sencillas Resolución de Mezclas Racemicas Biosensores Protección ó Desprotección Selectiva Inhibición Por S ó P Estereoespecificidad Especificidad Regioselectividad

13 SINTESIS CINETICAMENTE CONTROLADA
OR’ R C O NH R’’ S + NH2 R’’ + R’ OH E h1 h2 RCOOH R’OH NH2 - R’’ CONDENSACION MUY SELECTIVA EN CONDICIONES MUY SUAVES Transamidaciones Transesterificaciones Ester amido Amido ester Transglicosilaciones

14 LA SINTESIS CINETICAMENTE CONTROLADA
ALGUNOS PARAMETROS QUE DEFINEN LA SINTESIS CINETICAMENTE CONTROLADA

15 1.- Saturación del Centro Activo de la Enzima por el Nucleófilo
H2O SINTESIS HIDROLISIS [ nucleófilo ] S / h

16 2.- Tasa Máxima Síntesis / Hidrólisis
H2O A s / h [ nucleófilo ]

17 3.- Tasa Síntesis / Hidrólisis del Producto
OH R C O OMet NH R’ OMe NH R’ [ P ] tiempo

18 OPTIMIZACION DE LA SINTESIS CINETICAMENTE CONTROLADA
tiempo s / h [ nucleófilo ]

19 DIFERENTES ENZIMAS adsorción nucleófilo tasa s / h1 tasa s / h2
E. coli K. citrophila adsorción nucleófilo tasa s / h1 tasa s / h2 estabilidad actividad DIFERENTES ENZIMAS

20 DIFERENTES DERIVADOS adsorción nucleófilo tasa s / h1 tasa s / h2
estabilidad actividad DIFERENTES DERIVADOS

21 DISEÑO MEDIO DE REACCION
Actividad Estabilidad Adsorción Nucleófilo Tasa s/h1 Tasa s/h2 Efecto Fisico - Químico 2 1 ionización substratos fuerzas electrostáticas fuerzas hidrofóbicas

22 SISTEMAS BIFASICOS E + E fase 2 fase 1 RCOOH + MetOH + NH2 - R’ NH2 R’
OMe NH R’ + E h1 h2 S R C O OMet NH2 - R’ E NH R’ fase 2 fase 1

23 + SINTESIS DE ANTIBIOTICOS LACTAMICOS D - Phegly 7 ACA Cefaloglicina
Activación grupo carboxilo cadena lateral Protección grupo carboxilo anillo antibiotico Protección grupo amino D- Phegly Utilización bajas temperaturas Utilización medios muy contaminantes Utilización reactivos muy tóxicos Necesidad de utilizar compuestos puros D - Phegly 7 ACA Cefaloglicina O C N H 2 + CH2 - O - C - CH3 S NH2

24 + SINTESIS ENZIMATICA DE ANTIBIOTICOS PGA D - Phegly 7 ACA
VENTAJAS No es preciso proteger los grupos que no se desea que reaccionen La reacción transcurre en condiciones poco contaminantes La presencia de contaminantes no activados no deberia producir subproductos Posibilidad de utilizar mezclas racémicas de donadores de acilo Posibilidad de utilizar el núcleo sin purificar C O CH2 - O - C - CH3 S N H 2 R Cefaloglicina NH2

25 + + SINTESIS TERMODINAMICAMENTE CONTROLADA E E
40-60% DMF pH 6-7 + CH2 C O H NH2 R CH2 C NH O R E 90-95% DMF pH 8-9 + CH C O O H NH2 R CH C H2 R O N E NH3+ NH2 PA capaces de reconocer grupos cargados PA activos y estables en 90 / 95% DMF

26 SINTESIS CINETICAMENTE CONTROLADA
DE ANTIBIOTICOS S N O R COOH H 2 S C H N 2 O COOH S R C O M e H N 2 + PGA h1 h2 S N O R COOH H 2 C H N 2 COOH + MeOH + tasa s / h1 Adsorción nucleofilo Actividad Estabilidad

27 MECANISMO CATALITICO DE PENICILINA G ACILASA
Análogos Fenilacético CH2 SO3 O OH CH2 SO3 F PMSF otros inhibidores serina PGA inhibida OH PGA NO inhibida

28 Vh1 Vs S / h1 D- MandOMe L - ManOMe D - PheglyOMe L - PheglyOMe 100%
EFECTO DEL DONADOR DE ACILO SOBRE LAS PROPIEDADES CATALITICAS DE PENICILINA G ACILASA Síntesis Cineticamente Controlada Vh1 Vs Hidrólisis en ausencia de Nucleofilo S / h1 D- MandOMe L - ManOMe D - PheglyOMe L - PheglyOMe 100% 25% 250% 5,7% 5% 3% 2,5% 66% 40% 20% 1,8 18 1,6 1,5 pH7, 100mM 6APA, 50mM ester 100% = Actividad con D-MandOMe

29 + A B D EFECTO DEL DONADOR DE ACILO EN LAS PROPIEDADES
DE PGA DE E.coli Centro Activo Diferentes Donadores de Acilo Diferentes Aperturas del Centro Activo OH C COOMe R ' + A B D

30 OPTIMIZACION DE LA TASA SINTESIS / HIDROLISIS DEL ESTER
Sintesis de Derivados del ácido D - mandélico

31 6,3 6,1 1,7 6 20% 100% 15% 40% SINTESIS DE DIFERENTES ANTIBIOTICOS
tasa s/h1 tasa s / h2 7 ACA 7 ADCA 6 APA 6,3 6,1 1,7 6 20% Actividad Residual 100% 15% 40% SINTESIS DE DIFERENTES ANTIBIOTICOS pH 7, 4ºC, 25mM D - MandOMe, 50mM núcleo antibiótico

32 EFECTO DEL pH Tasa S / h1 [ 6APA ] mM 1 2 3 4 100 250 500 pH 7 pH 6,5
1 2 3 4 100 250 500 pH 7 pH 6,5 pH 8 Tasa S / h1 [ 6APA ] mM

33 EFECTO DE LA TEMPERATURA
4 4ºC 37ºC 3 2 Tasa S / h1 1 100 200 300 400 500 [ 6APA ] mM

34 EFECTO DE LA FUERZA IONICA
1 2 3 4 5 6 100 200 300 400 500 [ 6APA ] mM Tasa S / h1 50mM fosfato 1M SO4 (NH4)2

35 EFECTO DEL METANOL 40% 20% 0% Tasa S / h1 [ 6APA ] mM 1 2 3 4 5 6 500
1 2 3 4 5 6 500 50 100 175 250 0% 20% 40%

36 + SINTESIS QUIMICA DE CEFAMANDOL Cefalosporina C 7 ACA 7 ACA - TM
COOH N S O C H 2 3 Cefalosporina C 7 ACA hidrólisis Purificación Modificación 7 ACA - TM Acido Adípico + Condensación CEFAMANDOL SINTESIS QUIMICA DE CEFAMANDOL Cefamandol

37 + SINTESIS QUIMICO-ENZIMATICA DE CEFAMANDOL Glutárico Mandelil 7 ACA
COOH S N O C H 2 3 CEFAMANDOL Cefalosporina C DAO Glutaril Acilasa PGA Condensación 7 ACA Glutárico + Modificación Química Mandelil 7 ACA Mandelil 7ACA Mayor solubilidad del núcleo antibiótico Mayor velocidad de reacción Ahorro de purificación SINTESIS QUIMICO-ENZIMATICA DE CEFAMANDOL

38 ( Síntesis de 7ACA - Mand ) ( Síntesis de 7ACA - Mand )
INFLUENCIA DEL DERIVADO. PREPARACION 2 4 6 8 tasa s / h1 ( Síntesis de 7ACA - Mand ) 20 40 60 80 100 Actividad Residual ( Síntesis de 7ACA - Mand ) pH 7, 4ºC

39 ( Síntesis de 7ACA - Mand ) ( Síntesis de 7ACA - Mand )
INFLUENCIA DEL DERIVADO. PREPARACION 8 20 40 60 80 100 6 4 2 tasa s / h1 ( Síntesis de 7ACA - Mand ) Actividad Residual ( Síntesis de 7ACA - Mand ) pH 7, 4ºC

40 Tasas Síntesis / Hidrólisis
ELECCION DEL DERIVADO. FUENTE MICROBIANA pH 7, 50mM 7ACA, 25mM Ester Tasas Síntesis / Hidrólisis ( 7ACA - Mand ) 2 4 6 8 E. coli K. citrophila Actividad Residual 20 40 60 80 100

41 OPTIMIZACION DE LA TASA SINTESIS / HIDROLISIS DEL ANTIBIOTICO
SINTESIS DE CEFALOGLICINA

42 CEFALOGLICINA: ANTIBIOTICO PRECURSOR DE OTRAS CEFALOSPORINAS
PGA H N S 2 O C H C O O M e + N O C C H C H C O N H S N H O C H 2 2 3 N H COOH 2 N O C H D-Fenilglicinato de Metilo O C H 2 C 3 7 ACA Cefaloglicina COOH O Otras Cefalosporinas C H N 2 COOH + MetOH S O 3

43 CURSO TEORICO Y REAL DE LA SINTESIS DE
10 20 30 40 50 [Cefaloglicina] producción (mM) [Fenilglicinato de metilo] consumido (mM) CURSO TEORICO Y REAL DE LA SINTESIS DE CEFALOGLICINA

44 Exceso de donador de acilo activado
ESTRATEGIAS PARA REDUCIR LA HIDROLISIS DEL ANTIBIOTICO Exceso de donador de acilo activado Condiciones donde la tasa actividad esterasa / actividad amidasa sea mayor Distorsión del centro activo de la enzima

45 EFECTO DE LA CONCENTRACION DE DONADOR DE ACILO
20 40 60 80 100 200 300 400 500 1000 2000 3000 4000 5000 [Fenilglicinato de Metilo], (mM) Rendimientos de Síntesis, (%) Actividad Sintética Inicial U / ml EFECTO DE LA CONCENTRACION DE DONADOR DE ACILO EN LOS RENDIMIENTOS Y EN LA VELOCIDAD INICIAL DE SINTESIS

46 ACTIVIDAD HIDROLITICA PGA
20 40 60 80 100 4 5 6 7 8 9 Actividad Relativa % ACTIVIDAD HIDROLITICA PGA pH CH C O OMe NH2 CH2 NH - R’ NH R’

47 DISEÑO DEL REACTOR Sistemas Bifásicos

48 ELIMINACION CONTINUA DE PRODUCTO
SISTEMAS BIFASICOS ELIMINACION CONTINUA DE PRODUCTO Fase 2 RCONH - R’ R COOMe R’ - NH2 R CONH - R’ E Fase 1 R COOH R’ NH2 + Me OH

49 E SISTEMAS BIFASICOS AGUA / DISOLVENTE Disolvente inmiscible
H C S R H+ 3 O- Fase acuosa E

50 SISTEMAS BIFASICOS ACUOSOS
FASE APOLAR ( POLIETILENGLICOL ) H H2N S C CO N H S N NH2 N CH2R O CH2R O C O OH C O OH H H2N C CO N H S S N NH2 N CH2R CH2R O O C O OH C O OH FASE POLAR (SALINA, DEXTRANO)

51 SISTEMA BIFASICO PEG 600 / SULFATO AMONICO
constantes de reparto Conc.PEG Conc. (NH4)2SO4 Reparto Cefalexina 7ADCA 100% 80% 60% FGM Ester FGAmida 3M 23,0 3,2 2M 9,4 3,1 6,1 2,1 4,5 2,0 4,0 1,8 3,0 1,6 7,5 6,9 5,0 2,2 1,2 1,1 1,4 1,45 1,42

52 Síntesis de Cefalexina en Reactor Bifásico y Homogéneo
Comparación Concentración de Reactivos: 50 mM 6APA, 50mM FGM. Ester Condiciones de Reacción: pH 6,5; T 15ºC; 3M (NH4)2 SO4 / 25mM Fosfato Reactor Homogéneo Reactor Bifásico Tiempo (h) Rendimiento (%) 10 20 30 40 50 60 6 8 4 2

53 VENTAJAS SISTEMAS BIFASICOS ACUOSOS
No es tóxico La enzima puede actuar en ambas fases El uso de derivados inmovilizados permite elegir la fase en la que la enzima realice su función Se puede manipular cualquiera de las fases: Sales Aditivos Codisolventes

54 NUEVAS PERSPECTIVAS Modificación química derivados PGA
Búsqueda de nuevas enzimas

55 Comparación del Derivado De PGA de E. Coli y el
Derivado Modificado Químicamente NH3+ COO- NH2 - CH2 - CH2 - NH2 EDC NH3+ B.. Síntesis de Cefalexina 10 / 10 A. Síntesis de Ampicilina 10 / 10 10 20 30 40 50 10 20 30 40 50 33 29 27 % Rend. Real % Rend. Real Tasa Tasa 21 D.Patron (1) D.52 (1) D. Patron (1) D. 52 (1) ( 1 ) 25 mM PO43-

56 SINTESIS DE AMPICILINA ACILASAS DE DIFERENTES MICROORGANISMOS
CATALIZADA POR ACILASAS DE DIFERENTES MICROORGANISMOS Escherichia coli Kluyvera citrophila Acetobacter turbidans Bacillus megaterium

57 SINTESIS ESTEREOESPECIFICA DE AMPICILINA
20 40 60 80 100 58 42 85 E.coli Acetob. 7 Rendimientos, (%) Síntesis con D- fenilglicina pura : D - ampicilina Síntesis con D,L- fenilglicina: D- ampicilina Síntesis con D,L- fenilglicina : L- ampicilina

58 INHIBICION POR ACIDO FENIL ACETICO
100 12,5 93 20 40 60 80 E.coli Acetob. Velocidade de Reacción, (%) Síntesis en ausencia de Ac. fenilacetico Síntesis en presencia de Ac.fenilacetico

59 SINTESIS DE AMPICILINA ACILASA DE Acetobacter vs. ACILASA DE E. coli
menor velocidad de hidrólisis del antibiótico mucho menor inhibición por fenilacético mucha mayor estereoespecificidad

60 CONCLUSIONES Adsorción Nucleofilo Tasa s / h1 Tasa s / h2 Derivado
Actividad Global Rendimientos Solubilidad Reactantes Estabilidad Catalizador Adsorción Nucleofilo Derivado [Substrato] Medio de Reacción Reactor

61 CONCLUSIONES Adsorción Nucleofilo Tasa s / h1 Tasa s / h2 Derivado
Actividad Global Rendimientos Solubilidad Reactantes Estabilidad Catalizador Adsorción Nucleofilo Derivado [Substrato] Medio de Reacción Reactor

62 CONCLUSIONES Adsorción Nucleofilo Tasa s / h1 Tasa s / h2 Derivado
Actividad Global Rendimientos Solubilidad Reactantes Estabilidad Catalizador Adsorción Nucleofilo Derivado [Substrato] Medio de Reacción Reactor

63 EFECTOS DEL METANOL EN LA SINTESIS CINETICAMENTE CONTROLADA
INGENIERIA DE LA REACCION EFECTOS DEL METANOL EN LA SINTESIS CINETICAMENTE CONTROLADA

64 EFECTO DEL METANOL 1,7 3 3,3 >20 1 4 0,6 0 % MeOH 40% MeOH
D-MandOMe D-PheglyOMe tasa s / h1 tasa s / h2 1,7 3 3,3 >20 1 4 0,6

65 POSIBILIDAD DE ENCONTRAR ENZIMA / DERIVADO / CONDICIONES Y REACTOR
DONDE “TODOS LOS PARAMETROS” SEAN ADECUADOS PARA UN PROCESO ECONOMICA / ECOLOGICA Y TECNOLOGICAMENTE VIABLE E R - COOMe NH2 R - CONH - R’ R’’’ - COOMe R’’ - COOH Condiciones cercanas a la estequiometria Concentraciones elevadas de producto Condiciones experimentales suaves Presencia de análogos de substrato que no interfieren

66 SINTESIS CINETICAMENTE CONTROLADA DE ANTIBIOTICOS  - LACTAMICOS
Enzima de E. coli soluble.... Rendimientos significativos de muchos antibióticos de interes DISEÑO DEL BIOCATALIZADOR / BIOPROCESO Utilización de penicilina acilasa de distintas fuentes Inmovilización / estabilización Modificación química posterior Diseño del medio reacción ( pH, temperatura, codisolventes, fuerza iónica ) Diferentes concentraciones de substratos ( relación, valores...) Utilización de sistemas bifasicos acuosos DIFERENTES MODOS DE OPTIMIZAR INDIVIDUALMENTE CADA PARAMETRO.... ACTIVIDAD / INHIBICIONES / ADSORCION NUCLEOFILO / TASA SINTESIS HIDROLISIS / HIDROLISIS PRODUCTOS

67 Exceso Ester Rdtos t s /h2
SINTESIS CINETICAMENTE CONTROLADA CEFALOGLICINA [MeOH] (%) Exceso 7ACA Rdtos t s /h1 Exceso Ester Rdtos t s /h2 89% 63% 10 85% 67% 20 80% 70% 30 70% 74% 40 60% 77% pH 7, 4ºC