Frecuencia de Reactividad IgE (%)

Presentación del tema: "Frecuencia de Reactividad IgE (%)"— Transcripción de la presentación:

1 Frecuencia de Reactividad IgE (%)
IDENTIFICACIÓN MEDIANTE CLONAJE MOLECULAR DE UNA PROTEÍNA DE UNIÓN A ÁCIDOS GRASOS DEL CAMARÓN Litopenaeus vannamei HOMÓLOGA A UN ALÉRGENO DE LOS ÁCAROS Leonardo Puerta, Marlon Munera, Elianny Pacheco, Dalgys Martínez, Luis Gómez, Josefina Zakzuk, Luis Caraballo Instituto de Investigaciones Inmunologicas, Universidad de Cartagena La alergia a los mariscos es un problema de salud mundial, su aumento o parece asociarse a un aumento en el consumo de alimentos como el camarón, el cual es una fuente alergénica importante, cuyos alergenos no han sido completamente descritos. Entre el camarón y otras fuentes alergénicas como los ácaros existen alergenos de reactividad cruzada, como la tropomiosina. En los ácaros se ha descrito al grupo 13, como alergenos con función de proteínas de unión a ácidos grasos (FABP), las presentan un alto grado de conservación en su estructura entre distintos organismos. Este hecho podría influir en la reactividad cruzada entre el camarón y los ácaros. Sin embargo, en el camarón no se ha descrito la FABP como alergeno y su participación en la alergia a los mariscos se desconoce completamente. En este trabajó se muestra la obtención de un posible nuevo alergeno del camarón Litopenaeus vannamei, homologo a los alérgenos del grupo 13 de los ácaros domésticos Alineamiento múltiple de FABP alergénicas. Las secuencias de aminoácidos de distintas FABP alergenicas se alinearon mediante CLUSTAL W, usando la herramienta T-COFFEE. Muestras de sueros. Se tomaron veintidós muestras de sueros de alérgicos y cuatro no alérgicos diagnosticados por prueba cutánea e historia clínica detallada de alergia. Se obtuvo el consentimiento informado para la toma de muestra y su uso en la investigación. Obtención de FABP de L. vannamei (LvFABP) recombinante. El recombinante LvFABP se expresó a partir de células competentes de E. coli BL21 Start (DE3) transformadas con un vector de expresión de la serie pET, conteniendo el segmento codificante de la FABP del camarón L. vannamei. La expresión se indujo con isopropil-tiogalopiranosido (IPTG) en medio LB con ampicilina por varias horas, Purificación de LvFABP. El recombinante fusionado a una etiqueta de Histidina (6xHis-Tag) se purificó mediante cromatografía de afinidad, usando resina de agarosa con Niquel. Las fracciones recolectadas se analizaron por SDS-PAGE. Reactividad IgE de LvFABP mediante ELISA. Se determinó la presencia de IgE específica a LvFABP mediante ELISA, usando placa de micro titulación cubiertas con 0.5 ug/100 ul de LvFABP por pozo. Se agregaron muestras de sueros de diluidos 1:5 y se incubaron toda la noche a 4ºC. Luego los pozos se lavaron e incubaron con Anti-IgE humana, conjugada a fosfatasa alcalina. La reacción se revelo con solución de sustrato (p-nitrofenilfosfato) y se leyó la densidad óptica (D.O) a 405 nm. Los valores por encima de 0.11 (D.O) se consideraron positivos. Se clonó y obtuvo de manera recombinante la proteína de unión a ácidos grasos del camarón L. vannamei. La fusión a una etiqueta de histidina permitió la purificación con una calidad óptima para los ensayos de reactividad IgE. Este recombinante mostró reactividad IgE positiva en 6 de los 22 sueros de alérgicos analizados, indicando que tiene capacidad de inducir sensibilización. Estos resultados ameritan que se continúe evaluando el papel alergénico de esta proteína, su importancia clínica en la población sensibilizada y su posible relación con proteínas homologas en otras fuentes de alérgenos. INTRODUCCIÓN MATERIAL ES & METODOS RESULTADOS Figura 1. Alineamiento múltiple entre distintas FABP alergenicas descritas en diferentes organismos invertebrados. Las flechas indican residuos altamente conservados en este grupo de proteínas. Entre la FABP del camarón y la de ácaros existe 46% de identidad en sus secuencias de amino ácidos. B A C La proteína recombinante mostro reactividad IgE en el suero de alérgicos a camarón mediante ELISA. A: Distribución de los niveles séricos de IgE . B: Estadística de los valores obtenidos en controles y alérgicos Figura 2. A: Mapa del vector de expresión pET 45b, utilizado en el clonaje y expresión de LvFABP. El segmento codificante se insertó entre las dianas de KpnI y PmlI. B: Expresión de LvFABP, las flechas indican la expresión de LvFABP (con un peso molecular aprox de 14 KDa) a diferentes tiempos de inducción y su presencia en el pellet (0P, 6PN y 6PI) o en el sobrenadante (0S, 6SN y 6SI). C: Purificación de LvFABP mediante cromatografía de afinidad. Mw marcador de peso molecular, L: muestra sin purificar, NU: no unido, Lv: lavado y F1-F3; fracciones con la proteína de interés. A P = 0.006 CONCLUSION B Estadistica Alérgicos Controles Valor Minimo 0,089 0,088 Valor Máximo 0,397 0,1060 Media 0,1215 0,09575 Frecuencia de Reactividad IgE (%) 27,27 0.0 AGRADECIMIENTOS Este trabajo fue financiado por la Universidad de Cartagena, (Contrato , IP: Prof. Leonardo Puerta, PhD.).