ACTIVIDAD DE ALGUNAS ENZIMAS PROTEOLÍTICAS DURANTE LA ONTOGENIA DE LARVAS DE CORVINA BLANCA (Atractoscion nobilis) Silvia Valverde1, Juan P. Lazo1 y Mark.

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1 ACTIVIDAD DE ALGUNAS ENZIMAS PROTEOLÍTICAS DURANTE LA ONTOGENIA DE LARVAS DE CORVINA BLANCA (Atractoscion nobilis) Silvia Valverde1, Juan P. Lazo1 y Mark A. Drawbridge2 1Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada (CICESE) Km 107 Carretera Tijuana-Ensenada. C.P Fax: Correo: 2Hubbs-Sea World Research Institute, San Diego, CA, USA Resumen El presente trabajo describe el desarrollo de algunas enzimas proteolíticas de larvas de corvina blanca (A. nobilis). A excepción de las proteasas ácidas, se detectó actividad de todas las enzimas evaluadas antes del inicio de la alimentación exógena, lo cual sugiere que su síntesis inicial no es inducida por la ingesta del alimento, sino por mecanismos endógenos. La actividad de proteasas ácidas (tipo pepsina), características de un estómago funcional, se detectó hasta 22 días después de la eclosión (DDE). Con base en el equipamiento enzimático de las larvas, es posible suponer que éstas podrían degradar microdietas formuladas desde el inicio de la alimentación exógena. El destete total podría realizarse al menos 22 DDE, cuando el estómago es funcional. Esto es una semana antes de lo establecido en el protocolo actual. Abstract The present study describes the development of some proteolytic enzymes of white seabass larvae (A. nobilis). All the enzymes assayed were detected before the commencement of feeding (except for the acid proteases), suggesting that their initial synthesis is triggered by endogenous mechanisms rather than by feed ingestion. Acid proteases (pepsin-like), characteristic of a functional stomach, were detected until 22 days after hatching (DAH). The enzymatic profile observed for the larvae suggests that they may be able to digest and assimilate microdiets from first feeding. Complete weaning could be achieved by 22 DAH, when the stomach is fully functional. This is one week before the time established in the current rearing protocol. Introducción El cultivo de larvas es considerado el principal cuello de botella en la piscicultura marina, siendo la nutrición de éstas uno de los factores críticos en la producción (1). Los estudios sobre la ontogenia de la fisiología nutricional de las larvas son por lo tanto de suma importancia. De manera particular, el estudio de la evolución del equipamiento enzimático, así como su caracterización y cuantificación, sirven para determinar la habilidad de las larvas de utilizar el alimento, para formular dietas adecuadas y establecer protocolos de digestibilidad in vitro (2). Además, se ha correlacionado el nivel de actividad de ciertas proteasas digestivas con la calidad de las larvas (3). El objetivo de este trabajo fue caracterizar la actividad proteolítica del sistema digestivo de larvas de corvina blanca durante la ontogenia para contribuir al entendimiento de su capacidad digestiva. 3.1 Actividad tipo Tripsina 3.2 Actividad tipo Quimiotripsina 3.3 Actividad de Leu-Aminopeptidasa 3.4 Actividad Proteolítica Alcalina PA ES Materiales y Métodos Se utilizaron larvas cultivadas en el Hubbs-Sea World Research Institute provenientes de distintos desoves. Los cultivos se realizaron en tanques circulares a una densidad de 40 larvas por L, salinidad de 32‰ y temperatura de C. La figura 1 muestra el protocolo de alimentación empleado. Se colectaron larvas en los días 3, 6, 9, 12, 17, 22, 28 y 31 después de la eclosión (DDE). Se registró la longitud estándar de cada larva, se disectó el sistema digestivo, se homogenizó y centrifugó. El sobrenadante se utilizó como extracto enzimático en las determinaciones posteriores. En la determinación de leu-aminopeptidasa se utilizó el extracto no centrifugado. La actividad proteolítica alcalina y ácida total se cuantificaron utilizando azocaseína (2%) y hemoglobina (1%), respectivamente. Se utilizó BAPNA (1 mM) para cuantificar la actividad tipo tripsina,L-leu-p-nitroanilido (1.2 mM) para leu-aminopeptidasa (4) y BTEE (0.56 mM) para medir actividad tipo quimiotripsina (3). Una unidad de actividad (U) se definió como un cambio en la absorbancia de 0.01/min o de 0.1/min en el caso de leu-aminopeptidasa y quimiotripsina. La proteína disuelta en los extractos se cuantificó mediante el método de Bradford, utilizando un kit de Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Inc. USA). Figura 3. Actividad total (U/larva) y específica (U/mg P) de diferentes enzimas proteolíticas durante el desarrollo de larvas de corvina blanca. Las barras representan el error estándar de la media (n=3-4). Las flechas indican el momento de la primera alimentación (PA) y el inicio de la formación del estómago (ES). Fish Food Artemia Mysis relicta (congelada) Alimento formulado La actividad específica (U/mg P) de las diferentes proteasas alcalinas varió en relación a cambios morfológicos del sistema digestivo o en la alimentación (fig. 3). Las larvas presentaron un primer pico de actividad específica entre 3 y 6 DDE. Este pico está asociado con la capacidad para iniciar la alimentación exógena, aunque no se les brindó alimento hasta 5 DDE. Posteriormente, descendieron los niveles de actividad y ocurrió un segundo pico 12 DDE. Este segundo pico podría estar relacionado con cambios en la alimentación de las larvas y en las condiciones de cultivo. Según el protocolo de cultivo empleado en el H-SWRI, a esa edad se les empieza a suministrar alimento formulado (finamente molido) a las larvas, al igual que Mysis congelada y Artemia (fig. 1). Así mismo, se empieza a incrementar la temperatura del agua de 18 a 23 C. Después del día 12, se encontró un descenso en la actividad específica de las larvas. Esto podría estar asociado con la formación y desarrollo del estómago (16 DDE), con lo cual se incrementa la proporción de proteínas estructurales y el desarrollo de la actividad de otras enzimas. No se detectó actividad de proteasas ácidas (tipo pepsina) hasta 22 DDE, cuando las larvas cuentan con un estómago bien desarrollado. La actividad ácida total incrementó de 26.5 U/larva en el día 22 a 97.3 U/larva en el día 31, y la actividad específica incrementó de 38.1 a 74.3 U/mg P. Figura 1. Protocolo de alimentación empleado en el H-SWRI durante el cultivo de larvas de corvina blanca Resultados y Discusión La figura 2 muestra el incremento en longitud estándar (LE) de las larvas de corvina blanca durante el período de muestreo. La longitud estándar fue proporcional a la edad de las larvas (r2= 0.95). Conclusiones Dado que se detectó actividad proteolítica antes del inicio de la primera alimentación exógena de las larvas, es razonable suponer que éstas poseen la capacidad para digerir microdietas formuladas. El destete total podría realizarse cuando el estómago es funcional (al menos 22 DDE), lo cual es una semana antes de lo establecido en el protocolo actual. A partir de este momento, los estudios deberían enfocarse en la selección de fuentes proteicas que puedan ser degradadas por el equipamiento enzimático de las larvas en cada fase del desarrollo, para así lograr formular microdietas inertes que logren reemplazar al alimento vivo. Figura 2. Crecimiento de la corvina blanca durante el período de estudio. n= 20 Las larvas presentaron actividad proteolítica alcalina desde antes de la primera alimentación exógena (5 DDE) (fig. 3), lo cual sugiere que su sintesis se debe a mecanismos genéticos o de otro tipo, más que por la ingesta inicial de alimento. La actividad total (U/larva) tipo tripsina y alcalina total (fig. 3.1 y 3.4) tendió a incrementar con la edad de las larvas, aunque presentó un pico 12 DDE, un segundo pico para tripsina 28 DDE y subsecuentemente un descenso en la actividad. El patrón mostrado por la actividad tipo quimiotripsina (fig. 3.2) fue diferente; ésta presentó un pico de actividad 22 DDE y volvió a incrementar 31 DDE. Estas diferencias podrían deberse a cambios ontogenéticos en la importancia relativa de dichas enzimas, como por ejemplo, la disminución en la proporción de tripsina acompañada de un incremento en la actividad de quimiotripsina. La actividad total de leu-aminopeptidasa (fig. 3.3) incrementó con la edad, indicando que hubo un adecuado desarrollo del epitelio intestinal. Agradecimientos A Christine Anderson y Antonio Rangel, técnicos del laboratorio de producción de larvas del H-SWRI, por su gran ayuda durante la toma de muestras. Referencias 1. Tanaka, M D. Agric. Thesis. Kyoto University, Japan. 136 p. 2. Alarcón, F.J Disertación. Universidad de Almería, España. 320 p. 3. Appelbaum, S. L Thesis. The University of Texas at Austin, USA. 85 p. 4. Lazo, J. P Dissertation. The University of Texas at Austin, USA. 212 p.