¿Qué debemos tener en cuenta en el manejo de la biopsia líquida?

Presentación del tema: "¿Qué debemos tener en cuenta en el manejo de la biopsia líquida?"— Transcripción de la presentación:

1 ¿Qué debemos tener en cuenta en el manejo de la biopsia líquida?
Beatriz Bellosillo Hospital del Mar, Barcelona SEAP, Madrid, Febrero 2017 1

2 Transl Lung Cancer Res 2016;5(5):466-482

3 Transl Lung Cancer Res 2016;5(5):466-482

4 Jung et al, Clinica Chimica Acta 411, 1611, 2010

5 Crowley et al, Nat Rev Clin Oncol 10:472, 2013

6 Jung et al, Clinica Chimica Acta 411, 1611, 2010

7 Clinical chemistry 61: 112, 2015

8 ADN Normal (Wild-Type)
ADN tumoral (Mutado) ADN Normal (Wild-Type) Inostics Laboratory Validations (internal). Diehl F, et. al Analysis of mutations in DNA isolated from plasma and stool of colorectal cancer patients. Gastroenterology Aug;135(2):

9 Detección de ADN tumoral circulante
(Mutado) 1% 100% 10% 0.1% 0.01% BEAMing Real-Time PCR PCR digital Pirosecuenciación Secuenciación Sanger Sensibilidad de detección (ADN mutado/ ADN total) ADN normal (Wild-Type) Inostics Laboratory Validations (internal). Diehl F, et. al Analysis of mutations in DNA isolated from plasma and stool of colorectal cancer patients. Gastroenterology Aug;135(2):

10 Detección de ADN tumoral circulante
(Mutado) El procedimiento pre-analítico puede MODIFICAR (INCREMENTAR ) el ADN de tejido no tumoral en la muestra Sensibilidad de detección ADN Normal (Wild-Type) Inostics Laboratory Validations (internal). Diehl F, et. al Analysis of mutations in DNA isolated from plasma and stool of colorectal cancer patients. Gastroenterology Aug;135(2):

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12 ANALITICA PRE-ANALITICA Extraccion Transporte Separación plasma
Extracción ADN PRE-ANALITICA ANALITICA

13 Brock et al, Translational Cancer Research 2015

14 Suero o plasma Tipo de tubos Tiempo hasta el procesamiento Alicuotado y almacenamiento Extracción de ADN Cuantificación de ADN

15 Suero versus plasma Plasma como mejor opción para estudiar CfDNA
Mayor concentración de ADN en suero que en plasma Mayor variabilidad entre pacientes en suero que en plasma Lisis de leucocitos durante la formación del coagulo Las vesículas-CfDNA se unen a fibrinógeno y fibrina Pérdida de la fracción plaquetar Plasma como mejor opción para estudiar CfDNA

16 Suero o plasma Tipo de tubos Tiempo hasta el procesamiento Alicuotado y almacenamiento Extracción de ADN Cuantificación de ADN

17 Selección de tubo de recogida
Anticoagulante : EDTA Heparina Citrato Adecuados si tiempo < 4-6 horas EDTA NO interfiere con PCR como la heparina Tubos EDTA como mejor opción para estudiar CfDNA

18 4h -6h

19 > 6h Lisis células hematológicas Aumento de la concentración de ADN
Dilución del ADN tumoral circulante > 6h

20 Selección de tubo de recogida
Diehl, AACR meeting 2016

21 Sherwood et al, PLOSone 2016

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23 Procedimiento 2x 2 tubos EDTA/K3 Centrifugar 1600g x 10 min
Alicuotar SN Extracción ADN

24 Suero o plasma Tipo de tubos Tiempo hasta el procesamiento Alicuotado y almacenamiento Extracción de ADN Cuantificación de ADN

25 Alicuotado y almacenamiento
Low binding tubes para minimizar adsorción del ADN a paredes del tubo Polipropileno>polietileno Almacenamiento de las alicuotas de plasma a -80ºC (preservar RNA)

26 Efecto del almacenamiento en la conentración de CfADN
El Messaoudi & Thierry

27 Suero o plasma Tipo de tubos Tiempo hasta el procesamiento Alicuotado y almacenamiento Extracción de ADN Cuantificación de ADN

28 Extracción de ADN

29 Suero o plasma Tipo de tubos Tiempo hasta el procesamiento Alicuotado y almacenamiento Extracción de ADN Cuantificación de ADN

30 Cuantificación de ADN Espectrofotómetro
frecuentemente utilizado (A260/A280) menos preciso Métodos fluorescentes – PicoGreen – unión de fluorocromo a ADN de doble cadena inespecífico (ADN viral…) Cuantificación por qPCR buena correlación con PicoGreen más caro y laborioso ¿selección de gen diana?

31 Verificación de la calidad y cantidad de ADN
DNA amplifiability is the best indicator of library performance. Comparing QC in matched FFPE (purple) and fresh frozen (green) samples, all but one sample (red) generated a successful library. With dCT cut off of 4, the sample preparation success rate is >99%. We see a range of ng suggested DNA input based on DNA quality.

32 Clinica Chimica Acta 412, 2085, 2011

33 El Messaoudi et al, CCA 2013

34 Superposición de los perfiles (rojo: QIAamp; azul: Magmax)

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36 Importancia de la cuantificación de ADN

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38 Máximo 4 horas desde la extracción 4 ºC o temperatura ambiente
Extracción de sangre Almacenamiento de sangre Obtención del plasma Extracción cuidadosa 10 ml sangre K3EDTA Vacutainer Streck tubes Máximo 4 horas desde la extracción 4 ºC o temperatura ambiente Centrifugación a 2X g, 10 min Alicuotar 1-2ml 2ª centrifugación en microcentrifuga a 16000g, 1 min (antes o despues del almacenado) Almacenamiento largo plazo Almacenamiento de ADN extraido Almacenamiento de plasma Almacenamiento: -20º o -80ºC Evitar congelación-descongelación Almacenamiento: -20º Evitar congelación-descongelación Extraccion Cf DNA inmediata : 4ºC hasta 3 horas Extracción no inmediata: -20ºC ó -80ºC Evitar congelación-descongelación

39 Conclusiones El procedimiento pre-analítico NO está estandarizado y es crítico para obtener resultados de calidad El plasma sería la muestra más adecuada Hay que minimizar el tiempo entre la obtención de la muestra y el procesamiento en el laboratorio

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