DISEÑO EXPERIMENTAL Y METODOLOGÍAS

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1 DISEÑO EXPERIMENTAL Y METODOLOGÍAS
Influencia del ciclo estral en la respuesta de células de granulosa de ovario bovino frente a análogos de la GnRH Carou MC, Cruzans PR, Lombardo DM. Área de Histología y Embriología, Intituto de Investigación y Tecnología en Reproducción Animal. Facultad de Ciencias Veterinarias, UBA. INTRODUCCION RESULTADOS Numerosos trabajos demuestran la presencia de receptores de GnRH (GnRHR) en células de granulosa (CG) de ovarios en distintas especies. Su relación con la función gonadal se demostró a través de la inducción de la apoptosis “in vitro” e “in vivo” empleando distintos agonistas de GnRH. Experimentos de nuestro laboratorio realizados con células de granulosa de ovario bovino para la línea establecida (BGC-1) incubadas por 24 y 48 hs de incubación, demostraron, que el agonista, acetato de leuprolide (LA) indujo apoptosis de manera dosis dependiente y creciente con la concentración siendo significativa con 100 nM. Los resultados obtenidos para los cultivos primarios de granulosa ovárica bovina (CPGB) fueron variables respecto de la concentración de LA (1, 10 y 100 nM) mostrando dos tipos de respuesta, una similar a la observada en BGC-1 y otra inversa a la concentración donde las concentración de 1 nM de LA presentaba inducción significativa de la apoptosis. Esta variación de respuesta mostró asociación con la densidad de células por campo, la concentración de Progesterona en el fluido folicular (FF) y el tipo de curva de crecimiento celular. Nuestro objetivo entonces fue estudiar la regulación de la apoptosis por parte del LA en CG de cultivo primario (CPGB) en función de la presencia de CL en los ovarios punzados para analizar los factores que intervienen en el tipo de respuesta de los CPGB frente a dosis crecientes de LA. Con este fin se procedió a analizar la regulación de la apoptosis por parte del LA en función de la dosis (1, 10 y 100 nM), el tiempo de incubación (24 y 48 hs) y la presencia de cuerpo lúteo (CL). La apoptosis fue evaluada morfológicamente por tinción con hematoxilina. En CPGB, la respuesta dosis dependiente frente al LA fue variable, quizás como reflejo del grado de diferenciación de las CG (luteinización espontánea in vitro). Se observaron dos patrones de respuesta frente a la inducción de apoptosis por parte del LA. Los cultivos provenientes de ovarios con CL (fase luteal, con concentración de P4 mayor a 0,8 ng/célula en el fluído folicular (FF), determinado por RIA) presentaron respuesta directa con la concentración de LA siendo significativa con 100 nM LA (respuesta tipo 1, similar a la observada en BGC-1), mientras que en los cultivos provenientes de ovarios sin CL (fase folicular o de regresión luteal, con concentraciones menores a 0,8 ng/célula en el FF) la inducción de apoptosis se produjo frente a bajas dosis del agonista (1 nM LA), respuesta tipo 2. DISEÑO EXPERIMENTAL Y METODOLOGÍAS Cultivo celular: Se trabajo con cultivos primarios de células de granulosa bovina (CPGB), obtenidas por punción de folículos medianos (3-8 mm) a partir de ovarios con o sin cuerpo luteo (CL) crecidas durante 48 hs. en DMEM + F12 suplementado con 5% SFB, Glutamina (2 nM), Gentamicina (50 mg/l), y Funguizona, CO2 al 5% y humedad a saturación, hasta la inducción. Se realizaron dos ensayos por triplicado. Tratamientos: 1) SFB 5% ) SFB 5% + LA 100 nM. 2) SFB 5% + LA 1 nM ) SFB 5% + LA 100 nM + ANT 100nM. 3) SFB 5% + LA 10 nM ) SFB 5% + ANT 100 nM. Análisis de figuras apoptóticas por tinción con hematoxilina: Las células fueron crecidas sobre cubreobjetos de 18 x 18 mm. Los tratamientos fueron frenados por fijación con metanol absoluto durante 10 minutos y secados al aire. Luego fueron teñidas durante 15 minutos con hematoxilina de Mayer y viradas con agua corriente tibia. Las células se secaron al aire por 1 hora y se montaron en DPX. Se realizó el conteo de imágenes de apoptosis en microscopio de campo claro (60 campos a 1000 x, aproximadamente 500 células por muestra). Las imágenes fueron capturadas utilizando un sistema de captura de imágenes consistente en un microscopio trinocular modelo DMLS de Leica y cámara con sensibilidad a fluorescencia modelo DC-180 de Leica Inc. El sistema se encuentra soportado por el programa IM50 de Leica. Análisis estadístico: Se realizaron dos experimentos por triplicado y se analizaron por ANOVA de dos vías y comparación e de medias de Bonferroni contra el control (α = 5%). Apoptosis en CPGB provenientes de ovarios sin CL, 24 hs de incubación. P = 0,0036; n=6. Curva de crecimiento por conteo de cámara de Neubauer en CPGB. Las células fueron obtenidas de ovarios con y sin cuerpo lúteo (CL) (n = 6). Sin CL las células se comportan de manera logarítmica (R2 = 0,9967) mientras que con CL el comportamiento fue exponencial (R2 = 0,9964). Apoptosis en CPGB provenientes de ovarios con CL, 24 hs de incubación. P = 0,0004; n=6. Niveles basales de apoptosis en CPGB provenientes de ovarios con y sin CL: p=0,05, n=6. CONCLUSIONES En CPGB, la respuesta dosis dependiente frente al LA fue variable, quizás como reflejo del grado de diferenciación de las CG (luteinización espontánea in vitro). Se observaron dos patrones de respuesta frente a la inducción de apoptosis por parte del LA caracterizados por el tipo de crecimiento, la concentración de P4 en el FF y la existencia o no de cuerpo lúteo (CL) en el ovario del que provenían. Se observó que los cultivos provenientes de ovarios con CL (fase luteal, con concentración de P4 mayor a 0,8 ng/célula en el FF) presentaron respuesta similar a la de BGC-1, mientras que en los cultivos provenientes de ovarios sin CL (fase folicular o de regresión luteal, con concentraciones menores a 0,8 ng/célula en el FF) la inducción de apoptosis se produjo frente a bajas dosis del agonista (1 nM LA). Teniendo en cuenta que las BGC-1 se han utilizado como modelo de CG inmadura, es posible que los cultivos provenientes de ovarios sin CL hayan respondido como lo hemos mostrado por ser células con un grado de diferenciación mayor. Proponemos como hipótesis que de acuerdo al grado de diferenciación de las CG se expresan diferentes conformaciones del GnRHR que varían en la respuesta ante el LA.