INMUNOHEMATOLOGÍA.

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1 INMUNOHEMATOLOGÍA

2 DEFINICIÓN: Es la parte de la hematología que estudia los procesos inmunitarios que tienen lugar en el organismo en relación con los elementos sanguíneos. Uno de los aspectos más importantes de la inmunohematología es el estudio y cuantificación de los grupos sanguíneos eritrocitarios que son componentes antigénicos presentes en la superficie de los hematíes, ya que se relaciona directamente con la terapéutica transfusional y la prevención de accidentes hemolíticos graves.

3 GRUPOS SANGUÍNEOS La determinación de los grupos sanguíneos constituye un requisito imprescindible para efectuar una transfusión sanguínea ya que la incompatibilidad entre donante y receptor puede ocasionar una brusca destrucción de los hematíes transfundidos, con riesgo para la vida del paciente

4 En primer termino se identificaron sobre los hematíes, pero luego se describieron determinantes antigénicos plaquetarios, leucocitarios y séricos. Los genes determinantes de los grupos sanguíneos transmiten, generalmente, caracteres codominantes ( se expresan en homocigotos y heterocigotos). Existen genes “amorfos” que no generan productos que puedan ser identificados como antígenos ( ej: gen d) Todos los antígenos de los grupos sanguíneos han sido definidos serológicamente por la presencia de sus anticuerpos correspondientes.

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6 Grupos Eritrocitarios y sus Antígenos
GRUPOS SANGUÍNEOS ANTÍGENOS MAS IMPORTANTES ABO A, B, AB, O Rh D, C, c, E, e MNS M, N, S, s, U Lewis Lea, Leb P P1, P2 Lutheran Lua, Lub Kell K, k, Kpa, Kpb Duffy Fya, Fyb Kidd Jka, Jkb

7 Karl Landsteiner ( ) GRUPOS SANGUÍNEOS 1900

8 SISTEMA ABO En 1900 Landsteiner descubrió que los hematíes de algunos individuos normales aglutinaban en presencia de suero de otros individuos también normales y en 1901 se descubrieron los antígenos A, B y O, este sistema de grupo permite realizar con seguridad las transfusiones sanguíneas. Este sistema de grupo sanguíneo es de gran importancia. Los epítopes implicados aparecen en muchas otras células aparte de los eritrocitos, y forma parte de los substituyentes glucídicos de determinadas glucoproteínas.

9 LOS GRUPOS SANGUÍNEOS SON ALOGÉNICOS.
La mayoría de los individuos desarrollan anticuerpos frente a los antígenos ABO alogénicos aunque no hayan sido expuestos a eritrocitos extraños; esta sensibilidad se debe al contacto con epítopos idénticos que casualmente expresan de forma rutinaria una gran cantidad de microorganismos. Los anticuerpos frente a los antígenos ABO son muy frecuentes, lo que hace especialmente importante la verificación de los grupos del donante y del receptor antes de llevar a cabo una transfusión sanguínea.

10 SISTEMA ABO: GENÉTICA. Interacción con el sistema Hh
Un sistema de grupo sanguíneo consiste en un locus génico que codifica un Ag de la superficie de las células sanguíneas (generalmente de los eritrocitos). En cada uno de los sistemas puede haber 2 o mas fenotipos. Por ejemplo, en el sistema ABO existen 4 fenotipos ( A, B, AB y O ), por lo tanto son posibles 4 grupos sanguíneos. Un individuo con un determinado grupo sanguíneo es capaz de reconocer los eritrocitos que posean antígenos de un grupo sanguíneo alogénico y producir ANTICUERPOS contra ellos.

11 El locus ABO tiene tres alelos: A, B y O, y por el hecho de ser diploide todo individuo será portador de dos alelos. Los genes A y B son codominantes,y producen enzimas que actuan como transferasas específicas, capaces de transformar por glicocilación la SUSTANCIA H, presente en todos los hematíes en los ÁNTIGENOS A y B, mientras que el gen 0 es recesivo, no expresando ningún producto antigénico. Ello hace que existan seis genotipos diferentes (AA, AO, BB, BO, AB y OO) pero solo cuatro fenotipos posibles: A, B, AB y 0.

12 SISTEMA ABO: Genotipos posibles para cada Fenotipo.
Grupo sanguíneo ( fenotipos) Genotipos posibles Antígenos Anticuerpos séricos frente a ABO Frecuencia (%) A1 A2 A1A1 A1A2 A1 O A2 A2 A2 O A Anti-B 45,56 B BB BO Anti-A 8,65 A1B A2B A y B ninguno 3,57 O OO H Anti-A y 42,10

13 SISTEMA ABO: GENÉTICA Los genes A y B controlan la expresión de las sustancias A y B. El gen 0 se denomina “amorfo” por no corresponderle ningun antígeno. Sin embargo, los hematíes del grupo 0 expresan un “antígeno H”, que es reconocido por determinados antisueros y lectinas vegetales.

14 SISTEMA ABH (Síntesis y estructura)
Existen dos tipos posibles de substancias precursoras para los antígenos ABH. TIPO I y TIPO II. Ambos constan de azucares idénticos, pero la unión de los azucares terminales difieren en ambos. El precursor de TIPO I tiene una galactosa terminal (Gal) unida a una N-acetilglucosamina subterminal (GlcNac) por una unión 1,3. Esos mismos azucares se unen mediante un enlace 1,4 en el precursor de TIPO II.

15 Sustancia precursora TIPO I
TIPO II GR GR Glc-NAC Glc-NAC Gal Gal Gal Gal Unión 1,3 Unión 1,4 Los mismos azucares se unen mediante un enlace 1,4 en el precursor de TIPO II. El precursor de TIPO I tiene una galactosa terminal (Gal) unida a una N-acetil-glucosamina subterminal (GlcNac) por una unión 1,3.

16 GEN H: SUSTANCIA PRECURSORA
La presencia de los antígenos A, B u O en los hematíes depende de la herencia de los genes alelicos, A, B y O. Un gen H situado en un locus separado codifica la sustancia precursora sobre la que actúan los productos de los genes A y B.

17 GEN H: SUSTANCIA PRECURSORA
Las sustancias H, precursora de los antigenos A y B, se forman por adición de una fucosa (Fuc) a la galactosa terminal (Gal) ya sea en las cadenas de TIPO I o en las de TIPO II. Después de añadirse la fucosa a la cadena de TIPO II, la estructura que se obtiene se denomina “Sustancia H de TIPO II ”. Los antígenos ABH de los hematíes derivan de las cadenas de TIPO II, mientras que, los antigenos ABH del plasma provienen de los precursores de TIPO I y de TIPO II.

18 Sustancia H TIPO I Sustancia H TIPO II Gen H GR GR Gal Gal Gal Gal Fuc
Glc-NAC Glc-NAC Gal Gal Gal Gal Fuc Fuc 1,2 fucosiltransferasa Gen H

19 1,3 N-acetilgalactosaminiltransferasa
GR ANTÍGENO A (TIPO II) Glc-NAC Gal NAcGal Gal Fuc 1,3 galactosiltransferasa GR ANTÍGENO B (TIPO II) Glc-NAC Gal Gal Gal Fuc

20 SUBGRUPOS ABO Von Durgern y Hirszfeld en 1910 descubrieron estos subgrupos. Al observar que si al suero del grupo B se adiciona sangre del grupo A, hace perder su poder de aglutinación y así mismo podía continuar aglutinando otras sangres de los grupo A y AB. Así surgieron los subgrupos de estos grupos A1, A2, A1B y A2B. Fenotipo A A2 Frecuencia % % Sustancia H H1 Precursora H H2 H3 H4

21 DETERMINACION DE SUBGRUPOS ABO
Los subgrupos de A : A1 y A2 serològicamente se diferencian por su comportamiento frente a extractos vegetales denominados “LECTINAS”. Se determinan con el empleo de: LECTINA anti-A1 de Dolichos biflorus. LECTINA anti-H de Ulex europeaus.

22 DETERMINACION DE SUBGRUPOS ABO
Se clasificaron como fenotipo A1 los eritrocitos que reaccionaron con una intensidad de 4 cruces de aglutinación con el anti-A1 y no reaccionaron con el anti-H. Se consideraron hematíes de fenotipo A2 aquéllos que no reaccionaron con el anti-A1 y mostraron una intensidad de 2 cruces de aglutinación con el anti-H.

23 GRUPO BOMBAY Los individuos con genotipo HH o Hh producen la enzima 1,2-fucosiltransferasa que transforma la sustancia precursora en Sustancia H. Los individuios con fenotipo BOMBAY con genotipo hh no producen dicha enzima, por lo que no pueden modificar la sust. precursora, lo que hace que no puedan sitetizar SUSTANCIA H. Esto condiciona a que los genes del sistema ABO (si los tuviesen ) no pueden expresarse, por lo que parecen ser del grupo O. Presentan de manera constante además de anti-A y anti-B, un anticuerpo natural anti-H muy activo a 37ºC, capaz de hemolisar los hematíes de cualquier individuo que no sea de fenotipo BOMBAY.

24 El anti­AB producido en individuos de fenotipo O no es una mezcla de anti­A y anti­B, sino que se trata de un tercer anticuerpo que presenta reacción cruzada con un antigeno presente en los hematíes AB. Este antigeno se denomina “Antigeno C” o “Compuesto AB”. Los títulos de anti­A y anti­B con frecuencia están disminuidos en pacientes ancianos y con hipogammaglobulinemia, por lo que puedo tipificar erróneamente cuando haga el GRUPO SERICO. Los RN no producen títulos normales de anti­A y anti­B hasta los 3­6 meses de edad, alcanzando el titulo máximo entre los 5 a 10 años de edad.

25 Grupo sanguíneo A B AB O Glóbulos rojos                                                                                                             En la membrana    Antígeno A     Antígeno B Antígenos A y B No antígenos En el plasma Anti-B Anti-A No anticuerpos Anti-A y Anti-B

26 SISTEMA RH En 1939 Levine descubre que una mujer embarazada forma anticuerpos contra un antigeno eritrocitario de su hijo, el Rh (D). Es asi como se descubre la existencia de ALOANTICUERPOS. En 1940 Landsteiner y Weiner inyectaron glóbulos rojos de primates (Macacus rhesus) en conejos, luego extrajeron suero de los conejos inmunizados y observaron que aglutinaban el 85 % de los hematíes de los primates y el mismo porcentaje en humanos.

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30 -Se heredan de cada progenitor 3 genes. -Situados en loci próximos.
FISHER-RACE: -Se heredan de cada progenitor 3 genes. -Situados en loci próximos. -Los alelos se designan: D y d, E y e, C y c. -Cada gen codifica para un Ag especifico: D, C, c, E , e. * -La presencia o ausencia del Ag D determina si un individuo es Rh positivo o Rh negativo.

31 WIENER: -Herencia de un solo gen procedente de cada progenitor. -Cada gen con una estructura de mosaico. -Ej.: El gen R1, codificaría factores que corresponden a C, D y e de la nomenclatura Fisher- Race; el gen r produciría los antígenos c y e pero no D, C, ni E.

32 Comparación de las nomenclaturas para los Ag del Sistema Rh
Wiener Fisher –Race Rosenfield Rho D Rh1 rh` C Rh2 rh” E Rh3 h`r c Rh4 hr” e Rh5

33 Fisher-Rice Fenotipos Genes Rh+ CDE Cde cDE cDe Rh- CdE cdE cde

34 RhD + RhD - Actualmente: Actualmente:
Grupo sanguíneo complejo y polimórfico Está compuesto por más de 48 antígenos D (RhD positivo, RhD negativo) Actualmente: Grupo sanguíneo complejo y polimórfico Está compuesto por más de 48 antígenos D (RhD positivo, RhD negativo) C c E e RhD - RhD + Patogénesis de la EHFN, algunas AHAI y reacciones hemolíticas postransfusionales Funciones biológicas: mantenimiento de la arquitectura de la membrana eritrocitaria, proteínas transportadoras de NH4+ ?, CO2 ?

35 Número de antígenos: > 48 Terminología:
ISBT (símbolo) RH ISBT (número) Otros nombres Algunas veces llamado incorrectamente sistema Rhesus Expresión: en células rojas de cordón , GR de adulto, carece de formas solubles y es específico de la línea eritroide

36 Características del Antígeno D
a sitios D Ag de maduración eritroide Polipeptidos membranales hidrófogos (28-32 Kda) No están glicosilados ni fosforilados Poseen residuos palmitilados y acilados Asociados al citoesqueleto Marcadores de línea celular

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39 COMPLEJO RH Polipéptidos Rh Glicoproteína asociada Rh50 Otras glicoproteínas LW, GPB, CD47 y Banda 3

40 Complejo Rh RhD

41 Dce dce DCE dCe DcE dcE Dce dCE
Los antígenos más comunes del sistema Rhesus son definidos por 5 antisueros: anti-D anti-E anti-C anti-e anti-c Haplotipos Rh Los genes RHD y RHCE se encuentran dispuestos en tandem formando 8 posibles haplotipos: Dce dce DCE dCe DcE dcE Dce dCE

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43 Haplotipos Rh Variación de frecuencias en los distintos grupos étnicos. El gen RHD no codifica antígenos antitéticos, la cigosidad del mismo en los distintos fenotipos RhD+ no puede determinarse por métodos serológicos directos sino que es inferida en términos de probabilidad según el fenotipo Rh y las frecuencias de los haplotipos RH en los distintos grupos étnicos.

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45 Antigeno D debil El antígeno Du aparece como un Rh(+) con ciertos antisueros y como Rh(-) con otros El antígeno Du se transmite según las leyes de Mendel Existen dos tipos de Du

46 Determinación de Ag D debil
Coombs Indirecto Enzimas proteolíticas Técnicas en gel Pruebas de absorción-elución (de referencia)

47 Antígeno relativamente raro en la raza blanca
Importancia Ø Es especialmente importante su detección en los dadores de sangre (el antígeno Du es inmunógeno) Ø En las mujeres embarazadas (no debe aplicarse la gamaglobulina anti-D) Antígeno relativamente raro en la raza blanca

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49 Haplotipos con deleción parcial
GR D-- un haplotipo raro. Produce D pero no C, c, E, e Los GR D-- tienen un número de sitios antigénicos particularmente elevado (son aglutinados en salino por anticuerpos IgG). Otros haplotipos raros: Dc- y DCW- Generan anti-Rh17

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54 ANTICUERPOS anti-Rh Todos los anticuerpos del Sistema Rh provienen de una alo-inmunización por embarazo o transfusión. Son Aloanticuerpos Este sistema no posee anticuerpos naturales Clase IgG (IgG1 ó IgG3) no aglutinantes en salino (enzimas, TCI) No fijan complemento Excepcionalmente IgM fuertemente aglutinantes El antígenos D es el mas inmunógeno. Los anticuerpos anti-Rh son clínicamente significativos.    Enfermedad Hemolítica Reacción Fetoneonatal Transfusional

55 Especificidades Anti-D: es el mas frecuente. Puede causar RT y EHFN severa. Anti-c: muy frecuente. Puede causar RT y EHFN severa. Anti-E: muy frecuente. Puede causar RT y EHFN severa. Anti-C: raramente solo; está presente en mezclas: antiC+D. Pueden provocar RT y EHFN. Anti-Cw: puede causar RT y EHFN. Anti-e: poco frecuente. Puede causar RT y EHFN. Especificidad encontrada frecuentemente como autoanticuerpos

56 Asociación a enfermedades
Los individuos con fenotipos Rh null padecen anemia hemolítica compensada. Se ha observado una expresión reducida de los Ag Rh y mosaicismo Rh en leucemias, metaplasia mieloide, mielofibrosis y policitemia. Los genes Rh y la esferocitosis hereditaria están ligados al cromosoma 1. En poblaciones del sudeste asiático con ovalocitosis los antígenos del Rh están expresados débilmente.

57 Luego de los antigenos A y B, el antigeno D es el mas importante en lo referido a la Practica Transfusional. En contraste con A y B, las personas cuyos hematíes carecen del antigeno D, no tienen regularmente el correspondiente anticuerpo. La formación de anticuerpos anti­D es siempre consecuencia de la exposición, por transfusión o embarazo, a hematíes Rh +. Las personas D- que reciben una unidad de sangre D +, desarrollan un anti-D en el 80% de los casos. A diferencia del sistema ABO, los antigenos del sistema Rh se encuentran solo en los hematíes. Los antigenos D, C, c, E y e son responsables del 90% de los casos clínicos que implican al sistema Rh. ( EHRN, Reacciones Transfusionales) Naturaleza del anticuerpo : IgG ( atraviesa la placenta, EHFN). Es frecuente generar aloanticuerpos complejos: anti-cE, anti-CD El anti-e es un anticuerpo “caliente” que suele aparecer en AHAI.

58 Determinacion del fenotipo Rh
En la practica clínica se dispone de para la tipificación del fenotipo Rh de : anti-D, anti-C, anti-c, anti-E y anti- e Determinacion del genotipo Rh La identificacion del fenotipo no siempre permite la deduccion confiable del genotipo, me permite deducir el genotipo mas probable.

59 Frecuencias fenotipicas del Sistema Rh
ANTIGENO Rh Frecuencia ( %) D (+) 85 D(-) 15 C 70 c 80 E 30 e 98

60 Capacidad inmunogenica
C…….e….….E…….c…..…D

61 ESTUDIO DEL FENOTIPO Y GENOTIPO RH EN LA POBLACION
Estudios serológicos Determinación del fenotipo Rh Estudios moleculares Obtención de ADN genómico de sangre periférica Micro método de salting-out Genotipificación RHD por PCR

62 Genotipificación Rh La determinación de las bases genéticas del Sistema Rh ha permitido el desarrollo de métodos de biología molecular para analizar la presencia del gen RHD en ADN genómico

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65 Los estudios realizados en la población analizada indicaron que los individuos RhD positivos poseen los dos genes RH, mientras que las personas RhD negativas tendrían solamente el gen RHCE. Las muestras D débiles fueron genotipificadas como RhD positivas permitiendo descartar fenotipos D negativos en muestras con aglutinación muy débil y la presencia de genes híbridos responsables del fenotipo DVI.

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68 La estrategia de PCR multiplex desarrollada es rápida, los productos de PCR pueden ser amplificados simultáneamente en una única reacción y diferenciados por electroforesis en geles de agarosa. El método es exacto y los resultados obtenidos presentan una estricta correlación con los observados utilizando técnicas de aglutinación con anticuerpos específicos. La genotipificación RHD es especialmente adecuada para ser utilizada en situaciones clínicas donde no son aplicables los métodos inmunohematológicos clásicos.

69 Otros grupos sanguíneos
Sistema Kell: Los antigenos mas importantes de este sistema son: K, k , Kpa, Kpb, Kpc, Jsa y Jsb. Todos de importancia clínica. El anti- K es el anticuerpo irregulas mas común después del anti-D, ya que puede causar severas reacciones transfusionales y EHFN. Es un anticuerpo del tipo IgG, que reacciona a 37 C por TCI. El anti- k fue encontrado por primera vez en una mujer cuyo bebe desarrollo EHFN. Tiene las mismas características del anti- K. Sistema Duffy. Sistema Kidd: Puede ocasionar EHFN y reacciones transfusionales hemoliticas. Sistema MNSs :EHFN y reacciones transfusionales hemoliticas. Sistema I/ i

70 FORMAS DE ESTUDIAR LOS GRUPOS SANGUÍNEOS
Hay diferentes formas de evidenciar una reacción Antígeno-Anticuerpo: Dado que los Ags eritrocitarios, se encuentran el la superfície de la células, las formas mas utilizadas para su estudio son: AGLUTINACIÓN y HEMÓLISIS. AGLUTINACIÓN RIA HEMÓLISIS ELISA INHIBICIÓN ABSORCIÓN Y ELUCIÓN PRECIPITACIÓN

71 ETAPAS DE LA AGLUTINACIÒN
La aglutinación se produce en dos etapas: La primera es la unión Ag-Ac La segunda la formación de puentes intercelulares que producen el fenómeno visible de la aglutinación.

72 PRIMERA ETAPA Está influenciada por las siguientes variables:
Temperatura: IgM reaccionan a 4ºC, IgG a37ºC Afinidad entre Ag y Ac PH optimo :6.5 y 7.6 Concentraciòn relativa del Ag y Ac.puede ocurrir disminuciòn de la aglutinaciòn cuando hay exceso de Ac(prozona) o exceso de Ag (postzona) Fuerza iónica del medio : al disminuir ,disminuye la nube de cationes que rodea lo GR favoreciendo la uniòn Ag- Ac Medios de potenciaciòn: *Soluciones de baja fuerza iònica :LISS: reduce la neutralizaciòn de cargas opuestas aumentando la velocidad de reacciòn y tambien la cantidad de Ac unido al hematíe. Tiempo de incubación: Las diferentes reacciones Ag-Ac alcanzan el equilibrio en tiempos diferentes. Incubación varía : 15 a 60 min

73 SEGUNDA ETAPA Potencial Z Densidad del Ag Clase de Ig involucrada
Para potenciar las reacciones de aglutinaciòn se emplean diversos métodos: centrifugación controlada, adición de medios macromoleculares, de Enzimas proteolìticas y el uso del test de Coombs permite detectar la sesibilizaciòn de los GR por IgG que generalmente no producen aglutinaciòn

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75 Potencial Z

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78 Enzimas proteolíticas que eliminan las cargas (-) de la superfície celular
Papaína Bromelina Eliminan el Acido Sálico Tripsina Otras sustancias: ● Albúmina bovina ● Dextrán

79 GR con menos cargas negativas en su superficie, lo que permite que se aproximen lo suficiente para que se establezcan los puentes de unión por moléculas de IgG.

80 Cuando en la reacción Ag-Ac intervienen Acs tipo IgM, las dos etapas se superponen y se observa fácilmente la aglutinación. Cuando en la reacción intervienen Acs del tipo IgG, se produce solamente la primer etapa. Hay fuerzas repulsivas que impiden a los GR su acercamiento lo suficiente para que se establezcan las uniones.

81 Soluciòn salina de baja fuerza iónica :LISS
Permite aumentar hasta 1000 veces la afinidad entre Ag y Ac. Aumenta la sensibilidad de la prueba de Coombs. Permite detectar Ac en baja concentración y de baja afinidad Permite reducir el Tiempo de incubaciòn de la Coombs de 30´ a 10´ Por esta razòn el TCI en LlSS es la prueba de elecciòn para la detecciòn e identificaciòn de Ac de tipo IgG Se la utiliza : Prueba de compatibilidad pretransfusional y detección de Ac irregulares en donantes y receptores, detección de Ac irregulares en embarazadas y tipificación de Ag eritrocitarios.

82 Antisueros específicos
Anti-A Anti-B Anti-D :pueden ser de origen Humanos,animal o monoclonales,tambien pueden ser extractos de tejidos vegetales (Lectinas).Se debe considerar la especificidad, tìtulo,intensidad de la aglutinaciòn, avidez Anticuerpos obtenidos por inmunizaciòn: Son policlonales (mezcla de Ac contra distintos epitopes d euna misma molècula) Se obtienen por imnunizaciòn de animales o persona sensibilizadas

83 Anticuerpos monoclonales
Se obtienen de los hibridomas son monoclonales (clon de células que poseen especificidad contra un único epitope). Los antisueros hemoclasificadores anti-A, anti-B y anti-AB son monoclonales El antisuero anti-D : mezcla de monoclonal IgM que favorece la reacciòn en placa y un Ac IgG policlonal humano para el TCI en la determinaciòn del Du

84 Reactivo Antiglobulina Humana
Se obtiene inyectando a conejos con globulinas humanas purificadas Reactivos poliespecíficos : Contiene 2 anticuerpos :anti-IgG y anti-C3d en los estudios de Ac irregulares ,la presencia de anticomplemento favorece la detección de anti-Jka ,anti-JKb, anti-K Cuando el test de CD da (+) ,debe investigarse mediante los sueros antiglobulina monoespecificos el tipo de anticuerpo o fracción del complemento unido al GR

85 Reactivo Monoespecifico:
Anti-IgG ,Anti-IgM, Anti-IgA Anti-C3d, Anti-C3b, Anti-C4b Se obtienen de modo análogo ,inyectándolas distintas fracciones separadas y purificadas a los conejos TCD: Sensibilidad : permite detectar entre 100 y 500 moléculas de Ig/GR y entre moléculas de C3d/GR

86 PRUEBA ANTIGLOBULINICA ( Coombs)
Detecta Acs de tipo IgG o fracciones del C`adheridos a los GR. Existen dos técnicas: a) Directa: Detecta Acs adheridos a los GR “in vivo”. b) Indirecta: Determina Acs existentes en el suero o plasma del paciente, previa incubación del suero con GR apropiados.

87 Fundamentos de la prueba de la AGH
1-Todas las moléculas de anticuerpos y los componentes del C’ son globulinas 2- Los animales inyectados con globulinas humanas producen anticuerpos contra la proteína extraña: suero AGH 3- El anticuerpo AGH se combina con la porción Fc de las moléculas de anticuerpos o con epitopes de las proteínas del C’ 4- Si el Ac o el C’ están unidos a los eritrocitos, se produce una aglutinación visible 5- Si el Ac está libre en el suero se consume el reactivo AGH

88 La AGH detecta estos Ac o componentes del C’ fijados al GR
Relevancia de la prueba de la AGH IgM pentamérica aglutinación monomérica sensibilización Molécula “puente” para aglutinar GR AGH IgG Se unen a GR ó activan C’ sin producir aglutinación Responsables de reacciones hemolíticas transfusionales y EHFN Anti-Kidd , anti-Duffy La AGH detecta estos Ac o componentes del C’ fijados al GR in vivo Prueba de la Antiglobulina Directa in vitro Prueba de la Antiglobulina Indirecta La prueba de la AGH es el método de elección para la detección de todos los Ac anti-eritrocitarios excepto los del sistema ABO

89 ● Investigación de reacciones dudosas en una transfusión.
DIRECTA: TCD ● Diagnostico de AH y EHRN. ● Investigación de reacciones dudosas en una transfusión. ● Investigación de enfermedades autoinmunes. INDIRECTA: TCI ● Screening de sueros de donantes y pacientes para Acs. ● Pruebas de compatibilidad previas a la transfusión. ●Identificación y titulación de Acs encontrados en sueros.

90 TEST COOMBS DIRECTO( TCD )
MUESTRAS SANGRE ANTICOAGULADA CON EDTA REACTIVOS ANTIGLOBULINA HUMANA POLIESPECÍFICO TECNICA SUSPENSIÓN HEMATIES AL % EN TUBO COLOCAR 2 GTS SUSPENSIÓN ( HACER POR DUPLICADO ) LAVAR CON SF 3 VECES DESCARTAR SOBRENADANTE Y AGREGAR 2 GTS SUERO COOMBS A UN TUBO CENTRIFUGAR INMEDIATAMENTE AL OTRO INCUBAR 10 MIN A T º AMB ANTES DE CENTRIFUGAR CENTRIFUGAR Y LEER 90

91 Cfg y leer. Aglutinación: PAD +
PAD para detectar IgG Lavar los GR para eliminar el suero Agregar AGH Cfg y leer. Aglutinación: PAD +

92 TEST COOMBS INDIRECTO (TCI )
MUESTRA SUERO FRESCO REACTIVO : SF O LISS , AGH , HEMATIES LAVADOS Y RESUSPEND AL 3-5 % TECNICA ROTULAR 2 TUBOS. COLOCAR 2 GTS DE SUSPENSIÓN AGREGAR 2 GTS SUERO PACIENTE CENTRIFUGAR Y OBSERVAR INCUBAR 30 MIN A 37 º C CENTRIF Y OBSERVAR AGLUTINACION Ó HEMÓLISIS LAVAR 3 VECES CON SF. EN ÚLTIMO LAVADO DESCARTAR SOBRENADANTE AGREGAR 2GTS AGH CENTRIFUGAR 92

93 LAVADO INADECUADO DE ERITROCITOS
MALA INTERPRETACIÓN DE PRUEBAS DÉBILMENTE (+) PÉRDIDA DE ACTIVIDAD DE LOS REACTIVOS CENTRIFUGACIÓN INADECUADA. 93

94 FALSOS POSITIVOS TUBOS DE VIDRIO MAL LAVADOS SOBRECENTRIFUGACIÓN
QUE LOS ERITOCITOS AGLUTINEN ANTES DEL AGREGADO DEL SUERO DE COOMBS 94

95 DETECCIÓN DE ACS IRREGULARES
MUESTRA SUERO FRESCO REACTIVO PANEL SELECTOR TECNICA LECTURA EN MEDIO SALINO Y TCI TITULACIÓN MUESTRA SUERO PACIENTE REACTIVO HEMATIES QUE EXPRESEN EL AG CORRESPONDIENTE AL AC A TITULAR EN SUSP ENTRE 3—5 % S F TECNICA VER CUADRO 95

96 DEL TUBO 2 SE TOMA 100 µL Y SE LO PASA A LOS DEMAS EN FORMA SUCECIVA
3 4 5 6 7 8 9 S F - 10 µL 100 µL DEL TUBO 2 SE TOMA 100 µL Y SE LO PASA A LOS DEMAS EN FORMA SUCECIVA RESERVAR 100 µL DEL TUBO 10 SUEROS GR DILUCION 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 96

97 INTERPRETACION EL TÍTULO ES LA INVERSA DE LA MAYOR DILUCIÓN DE SUERO QUE PRODUCE AGLUTINACIÓN VISIBLE

98 CRIOAGLUTININAS 98 MUESTRAS
SUERO SEPARADO DE UNA INCUBACUÓN A 37º C DURANTE 1 HORA REACTIVOS S F SUSP HEMATIES GRUPO O DE UN ADULTO AL 3—5 %, (AG I ) SUSP HEMATIES GRUPO O CORDON UMBILICAL 3-5 % ( AG i) SUSP HEMATIES DEL PACIENTE 3—5 % TECNICA PREPARAR 3 SERIES DE TUBOS 98

99 99

100 AGREGAR A TODOS LOS TUBOS 2GTS SUSPENSIÓN HEMATIES PACIENTE AGREGAR A TODOS LOS TUBOS 2 GTS SUSPENSIÓN HEMATIES DEL GRUPO O I AGREGAR A TODOS LOS TUBOS 2 GTS DE LA SUSPENSIÓN DE HEMATIES DE CORDON O i Incubar los tubos a 4 º c hs 100

101 DE CORDÓN , LA ESPECIFICIDAD ES ANTI i
PARA DETERMINAR RANGO TERMICO , EFECTUAR LAS TITULACIONES E INCUBARLAS A 37 º C ( 1H ) ,A 20º C ( 4 HS ) y A 4 º C ( 24 HS ) INTERPRETACION V N : TÍTULO MAYOR 32 SI DÁ (+ ) EN LA SERIE CON AUTOGLOBULOS Y GLÓBULOS DE ADULTO, LA ESPECIFICIDAD ES ANTI I SI DÁ ( + ) EN LA SERIE DE AUTOGLÓBULOS Y GLÓBULOS DE CORDÓN , LA ESPECIFICIDAD ES ANTI i SI DÁ ( + ) CON LAS 3 SUSPENSIONES ES NECESARIO EFECTUAR UN PANEL IDENTIFICADOR . 101

102 ALOINMUNIZACIÓN Formación de Acs en una persona al serle inyectados Ags de los cuales carece. Efectuada por: * Inyección IV de Ags (transfusiones) * Embarazo incompatible donde el feto tenga Ags de los cuales carece la madre. Los Acs formados pueden ser: _ IgG _ IgM * Anti-A, Anti-B: en personas grupo O. Acs IgG * Anti-D ( EHRN). (atraviezan la * Anti-C Barrera Placentaria) * Anti-E * Anti-K, Anti-c, …

103 E H F N

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106 Causas de inmunización
Conjunto de manifestaciones patológicas causadas por aloimunización materna a Ag celulares presentes en el feto heredados del padre que producen una respuesta inmune (Ac) en la madre Causas de inmunización Embarazo (parto 0,25 ml hasta 25 ml - 3er trimestre?) Transfusión Inyecciones de sangre (intramuscular) Puede afectar 1er emb Transplantes Drogadicción

107 Factores que reducen la posibilidad de inmunización
Respuesta inmune deprimida de la embarazada La respuesta inmune primaria es tardía y débil. Esto explica por qué el primer hijo no es afectado por la EHFN a pesar del pasaje de GR durante el tercer trimestre de embarazo, excepto si existe sensibilización previa. presencia concomitante de incompatibilidad ABO la tercera parte de la población está genéticamente determinada a no responder a la inmunización No todas se inmunizan – frecuencia inferior a la esperada - respuesta inmune materna Factores que incrementan el riesgo de inmunización Placenta previa, desprendimiento placentario, versión externa, cesárea, aborto, embarazo extrauterino, obtención de vellosidades coriales, amniocentesis, cordocentesis, drogadicción.

108 Etiopatogenia Estimulación antigénica durante el embarazo Pasaje de hematíes fetales a través de la placenta Ag D 38 días de gestación Respuesta secundaria materna En sensibilizadas, una mínima cantidad de GR fetales alcanza para desarrollar una respuesta anamnésica con producción de IgG Pasaje y acción de los anticuerpos maternos IgG1 e IgG3 - transporte activo a través de receptores específicos en la placenta. Fijación de los Ac a los Ag fetales destrucción de las células en el bazo e hígado del bebé. Anemia, hepatoesplenomegalia, edema focalizado en abdomen y cabeza, anasarca, hidrops fetalis. Los anticuerpos maternos también se encuentran en calostro y leche.

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110 CLASIFICACIÓN Según la especificidad del Ac
EHFN: por acs contra ags del sistema RH ( más severa ) Madres RH ( neg) sensibilizadas con anti-D EHFN: por acs contra ags del sistema ABO ( menos severa ) Madres de grupo “ 0 “ EHFN : por acs contra ags de otros sistemas

111 CAUSAS DE EHFN Incompatibilidad de grupo sanguíneo materno fetal Aloinmunización materna específica contra un determinado Ag fetal. Paso de Acs maternos al organismo fetal Acciones derivadas de la unión de los Acs maternos sobre los hematíes fetales.

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113 Consecuencias de la hemólisis
Prenatal Anemia Postnatal Ictericia Bilirrubina Kernicterus Efecto de la incompatibilidad ABO Protección contra la inmunización Rh: anticuerpos anti-A y anti-B

114 ENFERMEDED HEMOLÍTICA DEL RECIÉN NACIDO (EHRN)
* Ictericia Signos * Anemia * Esplenomegalia * Hepatomegalia Causas + común ( Incompatibilidad sanguínea materno-fetal)

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116 Estudios durante el embarazo
Mujeres RhD negativas, multíparas, politransfundidas, abortos, muertes neonatales y bebés afectados de EHFN. Estudios a la pareja ABO, Fenotipo Rh, Kell Prueba de compatibilidad conyugal Incompatibilidad potencial Incompatibilidad real Determinación el estado homo/heterocigota RhD en el padre - serología: genotipo más probable - biología molecular: detección de 1 caja Rhesus híbrida

117 DIAGNÓSTICO : Etapa prenatal
+ ABO , Fenotipo R D débil ( RH negativo ) Determinación Ag Kell INCOMPATIBILIDAD POTENCIAL Mujer “ O “ C c D E E k Hombre “ A “ C c D e e k INCOMPATIBILIDAD REAL Investigar Acs irregulares ( panel eritrocitario select) - Medio salino - Medio enzimático - LISS / Coombs

118 ESTUDIOS EN LA MUJER EMBARAZADA
Acs irregulares : título e identificación 16 / 18 sem Si es ( - ) repetir 28 / 32 sem Si es ( + ) repetir 20 / 22 sem ó c/ 15 dias si aumenta * Estudios de LA ( mujeres con título > 16 + historia obstetrica * Genotipificación R H D fetal * Feto – Ultrasonido EC ( hígado- bazo ) _ Muestra sangre fetal ( 18 sem )

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120 PRUEBAS DE CONFIRMACIÓN
* A la madre : Tipificación ABO Y RH ( VARIANTES DU ) Panel selector ( aloanticuerpos maternos ) * En el niño : Tipificación A B O y R H P C D H b , Hto cordón , BRR I de cordón Reticulocitos

121 Determinación prenatal del genotipo RHD
Protocolo de estudio Estudios inmunohematológicos en sangre materna: RhD y Anticuerpos Irregulares. Extracción de ADN de sangre periférica materna y líquido amniótico. Genotipificación RHD en ADN fetal. Determinación del origen fetal del ADN obtenido del líquido amniótico. Determinación de la cigosidad RHD paterna.

122 T T O de la mujer aloinmunizada
PLASMAFÉRESIS ( pueden ser removidos hasta un 75 % de alo Acs pero tienden a rebotar ) ADMINISTRACIÓN DE GAMMA GLOBULINA ( en altas dosis 400mg / kg de peso materno durante 5 días)

123 Postulados de acción : * La Ig podría causar la inmunomodulación de las células T y B maternas y efectuar una supresión de las síntesis de Acs. * Podria saturar los receptores Fc de la placenta disminuyendo el pasaje de Acs antieritrocitarios. * Podría atravezar la placenta y bloquear el sistema monocito _ ma crófago fetal, disminuyendo la destrucción de los hematies .

124 T T O FETAL Transfusión fetal intrauterina HTO 30 %
sem de gestación Sangre : < de 96 hs de extraída exenta de plasma y capa leucoplaquetaria libre de C M V irradiada ( evita el riesgo enf de injerto –huesped ) hematies A B O compatibles

125 HIDROPESÍA FETAL: Transfusión fetal intrauterina mediante CORDOCENTESIS. Inducción temprana del parto Transfusión directa de glóbulos rojos empaquetados (compatibles con la sangre del bebé) y también exanguinotransfusión del neonato para extraerle la sangre que contiene los anticuerpos maternos que están destruyendo sus glóbulos rojos. Amniocentesis para determinar la severidad Control de la insuficiencia congestiva y la retención de líquidos.

126 ETAPA POS NATAL----- T T O
Luminoterapia : oxidación de bilirrubina a bibiverdina Exanguinotransfusión : corrige la anemia ,elimina hematies sensibilizados, e Igs libres y reduce la brr Albuminoterapia : conjuga la Bili libre

127 El tratamiento del neonato ya afectado depende de la severidad de la condición.
LEVE: Aumento agresivo de líquidos Fototerapia usando lámpara de bilirrubina. KERNICTERUS: Exanguinotransfusion (pueden requerirse varias) Fototerapia

128 PREVENCIÓN Madre R H ( - ) no inmunizada : Dosis preventiva 28 sem Dosis dentro de las 72 hs pos parto con hijo Rh ( + )

129 La PREVENCIÓN es fundamental, y con esta vacuna prácticamente puede evitarse la enfermedad tratando a las mujeres Rh -, que aín no han desarrollado Acs frente al factor Rh +. (durante el 1er embarazo). Esta inyección previene la sensibilización de más del 95 % de las mujeres Rh-negativas. Sin embargo, los estudios demuestran que alrededor del 2 % de las mujeres embarazadas se sensibiliza antes de dar a luz. Por esta razón se administra la inyección de RhIg alrededor de la semana 28 del embarazo, así como también después del alumbramiento.

130 La gammaglobulina anti Rh, sólo es efectiva en prevenir la enfermedad.
NO LA CURA una vez que ésta se ha presentado. DESAFORTUNADAMENTE no existen medicaciones similares para prevenir una isoinmunizaciòn debida a otro antígeno de los eritrocitos (como Kell).

131 ¿Existe alguna manera de deshacerse de los anticuerpos de la madre?
No. Si bien una mujer puede no presentar síntoma alguno y permanecer enteramente sana, puede seguir produciendo anticuerpos como parte de su sangre. Si concibe y alumbra otros bebés de sangre Rh-positiva, éstos podrían padecer la intolerancia de Rh.

132 E H F N ----A B O Caso más frecuente Madre “ O “ Y feto “ A “
Frecuentemente sin significado clínico Se puede presentar en el primer embarazo

133 EHFN ABO Ac involucrados NO son los Ac naturales/regulares anti-A y/o anti-B y/o anti-ÁB (IgM) Ac formados como respuesta al estímulo antigénico: Transfusión (aloinmunización) Embarazo anterior (aloinmunización) Heteroantígenos (heteroinmunización): preparaciones farmacéuticas de origen animal, vacunas (medio de cultivo cerdo), suero antitetánico (caballo)

134 Mecanismos de Acción de los Ac maternos
Hemolisis moderada (no hay generalmente formas graves de la enfermedad) Neutralización parcial de los Ac por los células endoteliales, vasculares y tejidos del feto que poseen Ag A/B Fijación débil de las IgG sobre los GR, debido a la baja avidez de los Ac y la escasa cantidad de Ag eritrocitarios en el feto. Explicaría negatividad TCD. - Escasa actividad hemolítica de los Ac, minimiza la hemólisis intravascular.

135 MECANISMOS DE ACCIÓN DE LOS ACS MATERNOS
* Hemólisis moderada ( no hay formas graves ) * Neutralización parcial de Acs por las células endoteliales , vasculares, y tejidos del feto que poseen Ag A / B * Fijación débil de las Igs sobre los Gr , debido a la baja avidez de los Acs y la escasa cantidad de Ags eritrocitarios en el feto. P C D neg * Escasa actividad hemolítica de los Acs ( minimiza la hemólisis intravascular )

136 ESTUDIOS A REALIZAR Prenatal (embarazadas): Podría investigarse en embarazada de grupo O y esposo A/B los Ac anti-A/B de clase IgG (2-ME) pero solamente 1 de 3000 incompatibilidades ABO potenciales necesita exanguinotransfusión. Imposibilidad e inutilidad de un despitaje prenatal Posnatal Recién nacido: Grupo ABO y RhD TCD, TCD potenciado Medios macromoleculares Elución e identificación del Ac Madre Estudio de Ac anti-A y/o anti-B de origen inmune y titulación.

137 ESTUDIOS A REALIZAR PRENATAL : ( embarazada )
madre “ O “ – esposo A / B Determinar título de Ig G _ POS NATAL : recien nacido grupo A B O y R H P C D ( +, - débil )

138 HALLAZGOS HEMATOLÓGICOS EN EL RECIEN NACIDO
* Aumento de reticulocitos % evidencia de proceso hemolítico compensado * Eritroblastos en sangre periférica % * Microesferocitos 80 %

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141 T T O * Luminoterapia * exanguinotransfusión : ( sólo si la anemia es severa. Se utilizan gr “ O “ suspendidos en plasma de grupo A B )

142 FIN 142