Genomica y Genomas CA García Sepúlveda MD PhD Laboratorio de Genómica Viral y Humana Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de San Luis Potosí

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Genomas eucariotas La Genética, que es una rama del conocimiento muy joven, sus comienzos empíricos datan de hace unos 7000 años cuando se inció la domesticación de las plantas, se podria decir que realmente empezo cuando Gregor Mendel (nacido el 22 de julio de 1822 en Heinzendford, Austria), un modesto fraile agustino, presenta en 1865 su trabajo de investigación a la Sociedad de Historia Natural de Brün, con el título de "Hibridos en plantas".

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Genomas eucariotas Leyes Mendelianas Las Unidades Hereditarias (genes) se dan por pares (alelos) en los individuos. Los alelos segregan (se separan) para formar gametos. Algunos alelos ocultan el efecto de otros (dominan)

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Genomas eucariotas Que es el genoma El genoma es el conjunto de información hereditaria que define y determina como funcionan cada organismos viviente. Conjunto de todos los genes de un organismo. El depósito de ésta información es el Ácido Desoxiribonucleico o ADN. • El genoma esta organizado en cromosomas.

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Genomas eucariotas El genoma contiene toda la información de cómo funciona un organismo.

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Genomas eucariotas La genómica se dedica a identificar los genes presentes en los cromosomas y determinar cual es su función

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Genomas eucariotas Los genomas varían en tamaño y contenido de genes, usualmente (no siempre) en relación a la complejidad del organmismo.

Acercamientos para la secuenciación de genomas Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Genomas eucariotas Acercamientos para la secuenciación de genomas

Acercamientos para la secuenciación de genomas Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Genomas eucariotas Acercamientos para la secuenciación de genomas

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Genomas eucariotas Acercamiento manual

Acercamiento semi-automatico Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Genomas eucariotas Acercamiento semi-automatico

Acercamiento automatico Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Genomas eucariotas Acercamiento automatico

Video sobre secuenciación capilar Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Genomas eucariotas Video sobre secuenciación capilar https://www.youtube.com/watch?v=e2G5zx-OJIw

Proyecto del Genoma Humano Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Genomas eucariotas Proyecto del Genoma Humano •Inicia oficialmente en junio de 1991 por el Instituto Nacional de Salud de U.S. •Es un proyecto comparado al Proyecto Apollo (Primer hombre en la luna) •Participan 6 países (U.S. Inglaterra, Francia, Canada, Alemania y Japón) •La Meta: Secuenciar 3.2 x 109 bp en 15 años (leer durante 9.5 años en voz alta).

Proyecto del Genoma Humano Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Genomas eucariotas Proyecto del Genoma Humano •En 1996 se funda el National Human Genoma Research Institute (NHGRI) •Involucra a las Universidades y Centros de Investigación más reconocidos •Colabora el Instituto Sanger •Se dividen el trabajo por cromosomas •La meta se piensa cumplir para el 2005 con una probabilidad de error de 0.01% por base

Proyecto del Genoma Humano Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Genomas eucariotas Proyecto del Genoma Humano •Utiliza sistemas Robotizados y Bioinformáticos muy adelantados

Dentro del Instituto Sanger de Wellcome Trust (UK) Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Genomas eucariotas Dentro del Instituto Sanger de Wellcome Trust (UK) https://www.youtube.com/watch?v=WwV4jhxtMHI

Proyecto del Genoma Humano (version privada) Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Genomas eucariotas Proyecto del Genoma Humano (version privada) En 1992 J. C. Venter funda The Institute for Genomic Research (TIGR) y en 1998 funda Celera asociado con ABI. •Dice que va a secuenciar el genoma humano en 3 años. •ABI proporciona un poco más de 300 secuenciadores de 96 capilares. •Su intención es patentar genes. •Celera significa velocidad.

Secuenciación “Shot-gun” (escopetazo) Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Genomas eucariotas Secuenciación “Shot-gun” (escopetazo) A) vemos un acercamiento Shot-gun de genoma completo. B) Acercamiento jerarquizado (subclonación) de secuenciación por escopetazo.

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Genomas eucariotas En comparación a procariotas mil veces más grandes, pesados (# genes) y complejos. Al comparar genomas (tamaño, número de genes, complejidad) de eucariotas la linearidad se pierde...complejidad genómica no equivale a complejidad orgánica entre los eucariotas. Ploidia, generalmente diploide con la excepción de gametos. Menos restricciones espaciales, DNA almacenado en núcleo (desde 10 hasta 200 micras de diámetro). Compactación, hacen uso de diversos niveles jerarquicos de compactación...de nucleosomas a cromosomas. Mayor número de genes, sequencias repetitivas, genes de RNA, secuencias de utilidad desconocida....filosofia eucariota permite flexibilidad e inovación, la procariota es minimalista. !

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Genomas

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Genómica Conjunto completo de genes de un organismo. Secuencia completa de DNA. Conjunto de estrategias y tecnologías empleadas para la caracterización molecular del genoma. Genómica estrcutural Caracterización genómica Genómica funcional Proteómica Glicómica

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Genómica Mapeo por segregación (Linkage map) Rasgos fenotípicos o patologías Mapeo genético. Baja resolución, ubicación de genes. Mapeo físico. Localizaciones de marcadores. Distancias en pares de bases. Secuenciación. Secuencia nucleotídica completa.

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Genómica

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Genómica Abordajes de secuenciación: Mapeo y secuenciación (clon por clon). Secuenciación shotgun.

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Genómica Mapeo y secuenciación (clon por clon). Cromosomas artificiales de levaduras. Cromosomas artificiales de bacterias.

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Genómica - YACs Yeast Artificial Chromosomes Pueden acomodar cientos de miles de kb. Mb: megaYACs. Los insertos de DNA son preparados por enzimas de restricción. Se introducen en células de levadura para su replicación.

Usando YACs se pueden producir mapas de resolución de 0.7 centimorgan. Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Genómica - YACs Usando YACs se pueden producir mapas de resolución de 0.7 centimorgan. 1 cM=1Mb en humanos. cM es la distancia en la que se da una frecuencia de recombinación del 1%. YACs (desventajas): Ineficientes. Difíciles de aislar de las células de levaduras. Son inestables. Tienden a contener mosaicos de fragmentos de DNA. BACs: Resuelven los problemas anteriores.

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Genómica - BACs Bacterial Artificial Chromosomes Se basan en el plásmido F de E. coli. Naturalmente responsables de la conjugación entre células bacterianas. Insertos de 300,000 bp. El cromosoma de E. coli contiene 4 millones bp. Son estables in vivo e in vitro. BACs circulares superembobinados son resistentes a la ruptura.

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Genómica – Shotgun Sequencing Propuesta por Craig Venter, Hamilton Smith y Leroy Hood (1996). No requiere de mapeo. Inicia con clones BAC (150 kb). Secuenciación del inserto en ambos extremos con secuenciador automatizado (500 bp al mismo tiempo). Estas 500 bases sirven como una etiqueta: conector de secuencia etiquetada (STC) para cada clon BAC. Fingerprint con enzimas de restricción. Obtener la secuencia completa de un BAC de interés. Selección de otros BACs con mínimo traslape con el original y secuenciarlo. BAC walking.

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Breviario cultural: Citogenética Nucleolo = DNA codificante para rRNA Donde se ensambla el rRNA y proteinas para formar subunidades ribosomales. Se importan proteinas del citoplasma y luego del ensamblaje se exportan las subunidades completas. Cuerpo de Barr corresponde a Cromosoma X inactivado, solamente presente en mujeres o individuos con poliploidia X.

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Breviario cultural: Citogenética Eucromatina Baja captación de tinción de Feulgen. Material genético activo (genes expresados). Heterocromatina Alta captación de tinción de Feulgen. Geneticamente inactiva (p.ej., Curepo de Barr). Heterocromatina constitutiva (condensada a nivel orgánico*). Heterocromatina facultativa (condensación tejido-específica). * = Es decir, en todo el organismo.

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Breviario cultural: Citogenética

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Breviario cultural: Citogenética

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Viroides, partículas subvirales y priones ssRNA desnudos libres, 300 bp que fitopatogenos. No codifican para proteinas. Mejores candidatos para el material genético primordial. También acumulan mutaciones que pueden ser seguidas filogenéticamente. Bajo ciertas condiciones periódicas dos fragmentos pueden unirse para formar fragmentos mayores (recombinación linear). Algunos recombinantes poseen distintas propiedades patológicas, invasividad o interactivas.

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Viroides, partículas subvirales y priones Los Hepadnavirus (HBV) constityen los virus envueltos (membrana) más pequeños observados en animales con diámetros de viriones de hasta 42 nm. Los hepatocitos infectados también secretan Particulas Subvirales no infecciosas (SVP) que carecen de material genético y que tienen forma de esferas o filamentos. La producción de SVP supera a las 100,000 o 1'000,000 de partículas por célula. Desconocemos mucho al respecto... Probablemente resultante de maquinaria replicativa

Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos Viroides, partículas subvirales y priones Stanley Prusiner acuño término a principios de los 80s. Enfermedades neurológicas ocasionadas por agentes infecciosos resistentes a procesos de destrucción de ácidos nucleicos. Inicialmente controversial, ganó el Nobel de fisiología y Medicina del 1997. Enfermedades llamadas enceflaopatías espongiformes por aspecto histológico. Particulas proteicas con la capacidad de catalizar cambios irreversibles sobre otras proetinas, lo que lleva a la acumulación de ellas dentro de las celulas...lo que las mata. PrPC y PrPSc