Detección de biomoléculas Espectroscopía de absorción Espectroscopía de fluorescencia

Espectroscopía de absorción

Espectroscopía de absorción T: Transmitancia A: Absorbancia

Espectroscopía de absorción Lámparas: - visible, UV prox. Halógenas - UV: Deuterio xenon mercurio -Célula fotoeléctrica -Fotomultiplicador Prisma de vidrio: visible Prisma de cuarzo: UV Cubetas de vidrio o plástico: visible Cubetas de cuarzo: UV Cubetas termostatizadas Cubetas miniaturizadas Cubetas de flujo continuo

Espectroscopía de absorción Espectrofotómetros Colorímetros (región visible del espectro) Densitómetros (análisis de muestras en láminas) Espectrofotómetros de flujo continuo (cromatógrafos, p. ej.) Espectrofotómetros de doble haz Microespectrofotómetros, acoplados a microscopios

Espectroscopía de absorción Colorímetro Espectrofotómetro

Espectroscopía de absorción NanoDrop

Espectroscopía de absorción Lector de placas de ELISA Espectrofotómetro para placas

Espectroscopía de absorción Densitometría de geles de electroforesis con un escáner

Espectroscopía de absorción Espectrofotómetro “en línea” como detector de un cromatógrafo

Espectroscopía de absorción Espectro de absorción de los aminoácidos aromáticos

Espectroscopía de absorción Espectro de absorción del DNA

Espectroscopía de absorción 215-230 nm Minimum absorbance for nucleic acids Peptide bonds in proteins absorb light Measurements are generally not performed at this wavelength because commonly used buffers and solvents, such as Tris, also absorb at these wavelengths. 260 nm Nucleic acids have maximum absorbance Purines absorbance maximum is slightly below 260; pyrimidines maximum. is slightly above 260. Purines have a higher molar absorptivity than pyrimidines. Proteins have little absorbance at this wavelength. 270 nm Phenol absorbs strongly Phenol may be a contaminant in nucleic acid preparations. 280 nm Aromatic amino acids absorb light Nucleic acids also have some absorbance at this wavelength. 320 nm Neither proteins nor nucleic acids absorb Used for background correction since neither nucleic acids or proteins absorb at this wavelength.

Concentration of double-stranded DNA APPROXIMATING THE CONCENTRATION AND PURITY OF DNA, RNA OR PROTEIN IN A SAMPLE Concentration of double-stranded DNA ~ (50 µg/mL) X (absorbance at 260 nm) Concentration of single-stranded DNA ~ (33 µg/mL) X (absorbance at 260 nm) Concentration of RNA ~ (40 µg/mL) X (absorbance at 260 nm) Concentration of protein ~ 1 mg/mL X the absorbance at 280 nm ~ 15 mg/mL X the absorbance at 215 nm Purity An A260/A280 ratio of 2.0 is characteristic of pure RNA An A260/A280 of 1.8 is characteristic of pure DNA An A260/A280 of 0.6 is characteristic of pure protein Proteins and nucleic acids do not absorb at 320 nm. Therefore, if a sample absorbs at 320 nm, the absorbance is due to turbidity. The absorbance at 320 can be subtracted from the readings at 260 nm and 280 nm: Concentration of double-stranded DNA ~ 50 µg/mL (A260 - A320) Concentration of single-stranded DNA ~ 33 µg/mL (A260 - A320) Concentration of RNA ~ 40 µg/mL (A260 - A320) Notes: A ratio of 1.8 - 2.0 is desired when purifying nucleic acids. This method does not actually distinguish DNA and RNA from one another. A ratio of less than 1.7 means there is probably a contaminant in the solution, usually either protein or phenol.

Espectroscopía de fluorescencia Se basa en la capacidad de algunos compuestos para absorber radiación de una determinada longitud de onda y emitir luz de una longitud de onda mayor (fluorescencia).

Espectroscopía de fluorescencia Fluorímetros: Lámparas muy potentes (arco de xenon, p.ej) Sistemas monocromadores de gran resolución Detector no en línea con la lámpara Cubetas transparentes a luz de excitación y luz emitida

Espectroscopía de fluorescencia La espectroscopía de fluorescencia es más sensible que la espectroscopía de absorción El parámetro “equivalente” al coeficiente de extinción molar es el rendimiento cuántico molar, pero es muy difícil de usar en la práctica. Se usan valores relativos o se realiza una recta patrón. Desactivación de fluorescencia (“Quenching”), por moléculas que colisionen con el fluoróforo o por moléculas que se asocien con él y que alteren sus propiedades fluorescentes o que capten la fluorescencia emitida.

FRET: transferencia de energía de fluorescencia por resonancia Puede producirse transferencia de energía entre 2 fluorocromos si el espectro de emisión del primero solapa con el espectro de absorción del segundo. Es necesario que las dos moléculas estén suficientemente próximas. Permite sintetizar sustratos fluorogénicos de proteasas, por ejemplo. Permite detectar interacciones entre proteínas.

FRET: transferencia de energía de fluorescencia por resonancia PCR cuantitativa con sondas TaqMan

Fluorescencia in vivo Proteínas fluorescentes: GFP, green fluorescent protein Aequorea victoria

Bioluminiscencia [A] + [B] → [◊] → [Products] + light firefly luciferase (EC 1.13.12.7) Luciérnaga Photinus pyralis Luciferin + ATP → Luciferyl adenylate + PPi Luciferyl adenylate + O2 → Oxyluciferin + AMP + Light

Bioluminiscencia Aequorea victoria

pUbc Luc-T2A-p53dn-T2A-HrasV12, 24 h Ratón 1, high 4 min Ratón 2, high 6 min Ratón 3, high 6 min Ratón 4, high 10 min

Ensayos enzimáticos in vivo Actividad luciferasa para monitorizar un protocolo de terapia génica psiCHECK-2 Ultra, 8 min pUbc-LucT2A Ultra, 8 min pUbc-LucT2A super, 4 min