Prevención de Dekkera/Brettanomyces bruxellensis en vinos mediante un modelo matemático Dra. María Elena Sturm Laboratorio de Microbiología Enológica Centro de Estudios en Enología EEA- Mendoza INTA

Dekkera/Brettanomyces bruxellensis Levadura alteradora de vinos Dekkera bruxellensis Importantes pérdidas económicas 80 % producción nacional de vino Mendoza

UVA VINO CONSERVACIÓN

Dekkera bruxellensis Umbral de percepción y descriptores aromáticos asociados Vino tinto Aroma asociado 4-EF 620 ppb farmacia -clavel fenolado 4-EG 140 ppb especiado-clavo de olor EF:EG 8/10:1 420 ppb especiado – tabaco cuero - complejidad 620 ppb defecto establo – sudor animal – perro mojado

D. bruxellensis Morfología celular ojival con gemación multilateral (ángulo a 45º) Velocidad de crecimiento lenta Tolera elevadas concentraciones de etanol y SO2 Capacidad de crecer con escasos nutrientes y bajos niveles de oxígeno. Dekkera es generalmente descripta en las últimas etapas de la vinificación y se encuentra estrechamente relacionadas con finales lentos de fermentación, añejamiento en barrica y estibado en botellas

D. bruxellensis La incidencia real de Dekkera y su defecto en los vinos tintos está escasamente documentada en nuestro país. Diferentes tratamientos para el control de Dekkera efecto perjudicial en la calidad global del vino PREVENCIÓN

Validación en sustrato natural Microbiología Predictiva Modelos matemáticos Modelo logístico/probabilístico probabilidad de crecimiento variables ambientales Logit (p) = ln [p(x)/(1-p(x))] =β0+ Σ βi xi Validación en sustrato natural

D. bruxellensis Diversas investigaciones Crecimiento de especies de Dekkera Medios de cultivo Condiciones diferentes Variables individuales Aparición del defecto en vinos… … tiene relación con la cepa de D. bruxellensis presente? … tiene relación con las actividades enzimáticas de la levadura?...esas actividades dependen de la cepa de levadura presente? … tiene relación con la concentración de ácidos hidroxicinámicos iniciales? … en qué momento del crecimiento de la levadura se produce? … qué variables la condicionan?

Objetivo General Desarrollar un modelo matemático que permita predecir el riesgo de aparición de defectos fenólicos causados por Dekkera bruxellensis en función de las características de los vinos tintos de la región vitivinícola Mendoza.

Aislamiento e identificación de levaduras contaminantes Materiales y Métodos 48 muestras de vino tinto con alteración o defecto (región de Mendoza). Los vinos fueron filtrados por membrana y sembrados en superficie en medio selectivo Brettanomyces. Las colonias positivas para Dekkera fueron aisladas, purificadas e identificadas mediante PCR del dominio D1/D2 del gen ribosomal 26S seguido de secuenciación. Identificación

42 % (20/48) muestras vinos positivas en medio Brett Aislamiento e identificación de levaduras contaminantes RESULTADOS 42 % (20/48) muestras vinos positivas en medio Brett 75 % D. bruxellensis 15 % Candida vinaria 5 % Pichia membranifaciens 5 % Meyerozyma guilliermondii 100 % D. bruxellensis a: longitud del amplificado 26S, b: porcentaje de homología de la secuencia en estudio respecto de la secuencia de la base de datos.

Dpto de Ciencia y Tecnología Universidad de Santiago de Chile Caracterización de las actividades enzimáticas y producción de fenoles volátiles RESULTADOS Dpto de Ciencia y Tecnología de Alimentos Universidad de Santiago de Chile Actividad CD y VR de las diferentes cepas y fenoles volátiles finales * Una unidad   (U)  de actividad enzimática fue definida como la cantidad de enzima que consume 1 μmol de ácido p-cumárico por minuto a 40ºC. **Una unidad (U) de actividad enzimática fue definida como la cantidad de  enzima que consume 1 μmol  de NADPH por minuto a 25ºC. Los valores de la misma columna que presentan la misma letra no presentan diferencias significativas (Test de Duncan p<0,05)

Caracterización de las actividades enzimáticas y producción de fenoles volátiles Aparición del defecto en vinos… … tiene relación con la cepa de D. bruxellensis presente? … tiene relación con las actividades enzimáticas de la levadura?...esas actividades dependen de la cepa de levadura presente? … tiene relación con la concentración de ácidos hidroxicinámicos iniciales? … en qué momento del crecimiento de la levadura se produce? … qué variables la condicionan? Las actividades cumarato decarboxilasa y vinilfenol reductasa propias de cada cepa de D. bruxellensis no son indicadoras de la capacidad de la cepa para producir fenoles volátiles en medio de cultivo.

Producción de fenoles volátiles de cepas con diferentes actividades VR en medio simil-vino RESULTADOS Concentraciones de ácidos hidroxicinámicos y fenoles volátiles finales con las diferentes cepas de D. bruxellensis Letras diferentes indican diferencias significativas entre las cepas (Test de Fisher p≤0.05). ND: No detectado.

Producción de fenoles volátiles de cepas con diferentes actividades VR en medio simil-vino Aparición del defecto en vinos… … tiene relación con la cepa de D. bruxellensis presente? … tiene relación con las actividades enzimáticas de la levadura?...esas actividades dependen de la cepa de levadura presente? … tiene relación con la concentración de ácidos hidroxicinámicos iniciales? … en qué momento del crecimiento de la levadura se produce? … qué variables la condicionan? Las actividades cumarato decarboxilasa y vinilfenol reductasa propias de cada cepa de D. bruxellensis no son indicadoras de la capacidad de la cepa para producir fenoles volátiles en condiciones simil-vino.

Relación entre la concentración de ácidos hidroxicinámicos y la producción de etilfenoles RESULTADOS Concentraciones de ácidos hidroxicinámicos y fenoles volátiles Letras diferentes indican diferencias significativas entre cepas para una misma concentración de precursores (Test de Fisher p≤ 0.05)

Relación entre la concentración de ácidos hidroxicinámicos y la producción de etilfenoles Aparición del defecto en vinos… … tiene relación con la cepa de D. bruxellensis presente? … tiene relación con las actividades enzimáticas de la levadura?...esas actividades dependen de la cepa de levadura presente? … tiene relación con la concentración de ácidos hidroxicinámicos iniciales? … en qué momento del crecimiento de la levadura se produce? … qué variables la condicionan? Mayor concentración de ácidos hidroxicinámicos precursores permite una mayor síntesis de fenoles volátiles por D. bruxellensis en condiciones simil-vino, independientemente de la cepa involucrada.

Etapa del crecimiento de D. bruxellensis donde se sintetizan los fenoles volátiles RESULTADOS Poblaciones viables de las 5 cepas nativas de D. bruxellensis

Etapa del crecimiento de D. bruxellensis donde se sintetizan los fenoles volátiles RESULTADOS Poblaciones viables y concentraciones de precursores y fenoles volátiles Todas las cepas se comportaron de manera similar. Durante el primer ciclo de crecimiento de la levadura se produjo la completa transformación de los precursores hidroxicinámicos a fenoles volátiles. La máxima producción de etilfenoles ocurrió en la fase exponencial tardía y estacionaria temprana de la curva de crecimiento de la levadura. D. bruxellensis CH29 Laboratorio de Aromas EEA-Mendoza INTA

Etapa del crecimiento de D. bruxellensis donde se sintetizan los fenoles volátiles RESULTADOS Poblaciones viables y concentraciones de azúcares, ácidos orgánicos y etanol Las cepas consumieron completamente la glucosa en 3-5 días, la fructosa en 10-12 días y la trehalosa en 19-20 días. D. bruxellensis CH29 Depto. de Ciencia y Tecnología de Alimentos (USaCh)

Etapa del crecimiento de D. bruxellensis donde se sintetizan los fenoles volátiles Aparición del defecto en vinos… … tiene relación con la cepa de D. bruxellensis presente? … tiene relación con las actividades enzimáticas de la levadura?...esas actividades dependen de la cepa de levadura presente? … tiene relación con la concentración de ácidos hidroxicinámicos iniciales? … en qué momento del crecimiento de la levadura se produce? … qué variables la condicionan? La síntesis de fenoles volátiles se produce durante el crecimiento activo de D. bruxellensis en condiciones simil-vino.

Modelo Materiales y Métodos Diseño experimental factorial completo (total = 63 niveles diferentes –triplicado = 189 datos) Modelo probabilístico: Donde: β0, βi y βij coeficientes xi variables ambientales (etanol, pH y SO2 libre, valores físicos) dummy variable categórica (tiempo) ε término de error

Modelo RESULTADOS Modelo probabilístico global: Logit (p) = Ln (p/(1-p)) Logit (p) = 67,18 -12,76*[pH] -5,11*[Etanol] -1,48*[SO2 libre] +1.05*[Etanol*pH] +0,35*[SO2 libre*pH] +t Con los valores de la variable dummy: t=-3,09 para el primer nivel (t=1, 7 días). t=-1,05 para el segundo nivel (t=2, 14 días). t=-0,53 para el tercer nivel (t=3, 21 días). t= 0,00 como valor de referencia (t=4, 30 días).

Modelo RESULTADOS Interfaces de crecimiento/no crecimiento 3D para un nivel de probabilidad de 0,01 en función del pH, del etanol y del SO2 libre para los 4 períodos de tiempo Los círculos abiertos muestran las condiciones donde la levadura D. bruxellensis CH29 fue capaz de crecer.

Modelo RESULTADOS Perfiles de probabilidad de crecimiento en función del pH, manteniendo fijos los niveles de etanol en 10; 12,5 y 15 % (v/v), y los niveles de SO2 libre en 0, 30 y 50 mg/L para t=1 (7 días) y t=4 (30 días).

Modelo Perfiles de probabilidad de crecimiento en función del etanol % (v/v), manteniendo fijos los niveles de pH en 3,4; 3,7 y 4,0, y los niveles de SO2 libre en 0, 30 y 50 mg/L para t=1 (7 días) y t=4 (30 días). Perfiles de probabilidad de crecimiento en función del SO2 libre (mg/L), manteniendo fijos los niveles de pH en 3,4; 3,7 y 4,0, y los niveles de etanol en 10; 12,5 y 15 % (v/v) para t=1 (7 días) y t=4 (30 días).

Modelo RESULTADOS Interfaces de crecimiento/no crecimiento 2D en función del pH y del SO2 libre (mg/L) para diferentes niveles de etanol y períodos de tiempo Probabilidad de crecimiento fijada en p=0,01. Los círculos abiertos muestran las condiciones donde la levadura D. bruxellensis CH29 fue capaz de crecer.

Modelo Aparición del defecto en vinos… … tiene relación con la cepa de D. bruxellensis presente? … tiene relación con las actividades enzimáticas de la levadura?...esas actividades dependen de la cepa de levadura presente? … tiene relación con la concentración de ácidos hidroxicinámicos iniciales? … en qué momento del crecimiento de la levadura se produce? … qué variables la condicionan? Los diferentes niveles de SO2 libre, etanol y pH, así como las interacciones entre etanol*pH y SO2 libre*pH presentan un efecto inhibidor sobre el crecimiento de D. bruxellesis en condiciones simil-vino. El tiempo es un factor importante a ser considerado cuando se deben definir las concentraciones o niveles de los factores limitantes del crecimiento de D. bruxellensis. El modelo predictivo desarrollado permite estimar la probabilidad de crecimiento de D. bruxellensis en un vino con determinadas características (pH, etanol y SO2 libre) y posibilita conocer los niveles de estas variables que inhiben su desarrollo.

Probabilidad de crecimiento: Validación del modelo Materiales y Métodos Medio de cultivo simil-vino + D. bruxellensis B11 D. bruxellensis VC20 Vinos estériles + D. bruxellensis CH29 Incubación 28 ºC- 30 días Seguimiento mediante D.O. y recuento de viables (WL y medio Brett) Análisis variables químicas vinos (pH, etanol y SO2 libre) Vinos naturalmente contaminados con Dekkera Filtración por membrana 0,45 µm Probabilidad de crecimiento:

Valores experimentales Validación del modelo con diferentes cepas de D. bruxellensis RESULTADOS Nº Variables Valores experimentales Predicción del modelo pH Etanol (% v/v) SO2 libre (mg/L) B11 VC20 Valor predicho Probabilidad 1 4 10 creció crece 1,00 2 15 16 no creció 0,77 3 3,8 34 0,04 3,7 25 0,96 5 12,5 0,51 6 7 8 50 no crece 0,01 9 3,6 0,00 3,4 11 3,5 12 42 87,5 % (21/24) predicciones correctas 12,5 % (3/24) falsos positivos 100 % de predicciones exitosas Modelo predice por exceso

Validación del modelo en diferentes vinos estériles Variables Valor experimental Predicción del modelo Variedad pH Etanol (% v/v) SO2 libre (mg/L) Valor predicho Probabilidad 1 Caladoc 3,85 15,50 69,12 no creció  no crece 0,00 2 Corvina 3,49 14,30 32,00 3 Rondinella 3,50 17,92 crece 0,07 4 Mourvedre 3,69 14,45 25,60 5 Touriga Nacional 4,05 15,10 23,04 0,75 6 Nebbiolo 3,89 14,70 0,44 7 Grenache 3,77 14,90 0,10 8 Croatina 3,19 15,30 10,24 0,02 9 Nero d'avola 3,27 14,20 creció 0,14 10 Merlot 1 3,59 15,80 07,68 0,18 11 Merlot 2 3,57 14,10 0,66 12 Malbec 1 3,54 13,60 0,22 13 Malbec 2 13,40 20,48 0,13 14 Malbec 3 3,60 14,85 21,76 0,04 15 Malbec 4 3,56 29,44 0,01 16 Malbec 5 3,80 15,36 0,27 17 Malbec 6 3,20 15,60 18 Malbec 7 13,80 0,32 19 Malbec 8 3,74 16,64 20 Malbec 9 13,20 0,90 21 Malbec 10 3,42 14,00 8,96 22 Bonarda 1 12,70 0,87 23 Bonarda 2 3,63 12,80 0,74 24 Bonarda 3 3,22 14,35 11,52 0,06 25 Pinot Noir 1 08,96 0,38 26 Pinot Noir 2 3,87 0,91 61,5 % (16/26) predicciones correctas 31,0 % (8/26) falsos positivos 7,5 % (2/26) falsos negativos  92,5 % de predicciones del modelo exitosas error sesgado hacia falsos positivos (predice por exceso el crecimiento de la levadura).

Validación del modelo en vinos naturalmente contaminados RESULTADOS Nº Variables Valor experimental Predicción del modelo Vinos pH Etanol (% v/v) SO2 libre (mg/L) Recuento Predicción Probabilidad 1 Malbec Rva 2013 3,46 14,70 6,40 creció crece 0,40 2 C. Franc PNº 44,7 3,56 14,80 5,12 0,56 3 C. Franc 15/01/14 14,50 2,56 0,78 4 Lote Cabernet 3/12 14,30 0,55 5 SMB-1308-DPCS2 3,69 15,00 8,32 0,50 6 SMB-1319-PV(V) 3,51 15,30 0,27 7 SMB 1312-DP 13,60 0,89 8 SMB 1322-DP-LI 3,55 14,90 3,20 0,63 9 SMB-1323-C4 3,40 15,40 7,68 0,10 10 SMB-1324-J 3,60 15,70 3,84 0,38 11 SCS-1338-VA 3,44 0,36 12 2012 T 27- 13/148 3,52 13,40 0,91 100 % (12/12) predicciones correctas  100 % de predicciones del modelo exitosas Vinos con probabilidades de crecimiento 10-91 %

Aplicación

Aplicación

Aplicación

Aplicación

Aplicación Siempre es conveniente comprobar analíticamente los resultados de una adición de anhídrido sulfuroso a los vinos, y vigilar además muy de cerca la cantidad de SO2 total para no rebasar los límites legales establecidos. El desarrollo de este modelo predictivo presenta un elevado potencial para ser aplicado por las bodegas, brindando una herramienta de base científica para el control y la prevención de los defectos atribuibles a D. bruxellensis en vinos tintos.

Proyecciones 1) Optimización del modelo predictivo que incluyan: Relación entre la probabilidad de crecimiento calculada por el modelo y el tiempo para que el defecto se haga perceptible en los vinos. Relación entre la probabilidad de crecimiento calculada por el modelo y las poblaciones viables de Dekkera iniciales presentes en el vino. Validación del modelo en diferentes temperaturas. 2) Diseño de un plan de muestreo y control para vinos con diferentes probabilidades de crecimiento de Dekkera. 3) Construcción de una herramienta informática interactiva que pueda ser utilizada desde la página web de INTA con acceso libre y gratuito.

Trabajos publicados

MUCHAS GRACIAS POR SU ATENCIÓN!!! sturm.maria@inta.gob.ar