METODO DE PARTICION PARA E COLI Un método rápido es pasar la membrana con Coliformes totales o fecales a un agar nutritivo con MUG En este caso E coli se define como el Coliforme que produce la enzima ß-glucuronidasa e hidroliza el sustrato MUG (4-metil umbeliferil-B-D-glucurónido) para producir fluorescencia azulada alrededor de la colonia La incubación se realiza a 35 ± 0.5 °C durante 4hs y se observan las colonias fluorescentes bajo lámpara UV (366nm) Se puede optar por caldo EC-MUG (44.5 ± 0.2°C,24hs) y observar la fluorescencia bajo lámpara UV Agregar un control de medio de cultivo por autofluorescencia y un control positivo (E coli, MUG +) y uno negativo (Klebsiella penumoniae, MUG-)

RECUENTO DE MICROORGANISMOS VIABLES El recuento en placa de las bacterias con incubación aeróbica a 22 y 37°C representa el número de bacterias totales seleccionadas según: el medio de cultivo, temperatura y tiempo de incubación. ISO 6222: propone la supresión de glucosa del medio de cultivo (medio menos rico en nutrientes) y modifica las condiciones de incubación: 36±2°C (44±4hs) y 22±2°C (68±4hs) IRAM 29122: traducción de la ISO 6222 SM 9215 B: plantea el uso de PCA (altos nutrientes) sólo para comparaciones o continuidad con los datos antiguos ya adquiridos y recomienda el uso del R2A o HPCA agar. Incubación: 48hs a 35°C

PSEUDOMONAS AERUGINOSA: METODOS Membrana filtrante: SM 9213 E propone el uso del M-PA-C agar, incubación a 41.5±0.5°C por 72hs y confirmación en Milk Agar (35±1.0°C, 24hs) de un número de colonias típicas y atípicas La norma francesa NFT 90-421 propone el Agar Cetrimida suplementado con ácido nalidíxico como medio selectivo (37±1°C, 48±3hs) y observación de fluorescencia (por la producción de un pigmento azul-verdoso fluorescente) bajo lámpara UV. Confirmación crecimiento en Agar Nutritivo (42±0.5°C, 24hs) Método por NMP: SM 9213F propone el uso del caldo Asparagina (35 a 37°C, 24 a 36hs) para la etapa de enriquecimiento y caldo Acetamida (35 a 37°C, 24 a 36 hs) para la etapa de confirmación

ENTEROCOCOS: METODOS Membrana filtrante: NF EN ISO 7899-2, emplea el medio de Slanetz Bartley (37±1°C,48±3hs) que contiene azida de sodio y reduce el cloruro de trifenil-2,3,5- tetrazolium a formazán (coloración roja) y confirmación por transferencia de la membrana en forma invertida en agar BEA (azida bilis esculina) (44 ± 0.5°C, 30min) dando colonias negras por hidrólisis de la esculina Medios de cultivo: m-Enterococcus agar, KF Estreptococcus agar, D-coccosel, Chromocult Enterococos agar Por NMP: NFT-90-411, enriquecimiento en caldo azida dextrosa (37±1°C, 24-48hs) y confirmación en agar bilis esculina (37±1°C, 24-48hs) Medios de cultivo: Caldo Azida Dextrosa, Caldo Rothe, Caldo EVA, Caldo Azida Glucosa

ENTEROCOCOS: METODOS Agar Chromocult m-Enterococos Agar

CLOSTRIDIOS SULFITO REDUCTORES: METODOS Membrana filtrante: ISO 6461/2, eliminación de las formas vegetativas por calentamiento en baño de agua a (75±5°C, 15 min), filtración por membrana de 0.2µm ,para aguas contaminadas filtrar 10ml y ajustar diluciones. Incubar en condiciones de anaerobiosis (37±1°C, 20±4hs y 44±4hs), si esto no es posible informar resultados de (20±4)hs, se observarán colonias con halo negro por reducción del sulfito de sodio a sulfuro y combinación con la sal de hierro (citrato de hierro) Medios de cultivo: SPS agar, m-CP agar, TSC agar, Triptosa Sulfito Cicloserina agar, Sulfito Iron Base agar Por NMP: EN 26461/1, calentamiento por 15 min de la muestra y enriquecimiento en caldo DRCM (Diferential Reinforced Clostridial Broth)y anaerobiosis por agregado de capa de vaselina al tubo, incubar (37±1°C, 44±4hs) se consideran positivos los tubos con precipitado negro.

CLOSTRIDIOS SULFITO REDUCTORES: METODOS NMP: Caldo DRCM Membrana filtrante: Agar SPS

Métodos Enzimáticos para la detección de Indicadores Utiliza los sustratos hidrolizables para la detección simultánea de enzimas de E. coli y Coliformes totales y también Enterococos Disponibles en formato P/A, NMP o en multiplaca. Según el principio que utilice será la coloración final del reactivo : Enterolert®, IDEXX (Manafi, 1996), Colisure®, IDEXX (Mc Feters, 1995) Colilert®, IDEXX (Edberg, 1991 y 1998), m-Coliblue®, Hach ColiComplete®,BioControl Chromocult®, MerckMicroSure®, Gelman, Colifast Coliformes Totales Reactivo + Escherichia Muestra coli

Sustancia cromogénica Sustancias Cromogénicas disponibles para la detección de bacterias indicadoras Bacteria Sustancia cromogénica Enzima testeada Coliformes o-nitrofenil-ß-D-galactopiranósido (ONPG) 6-bromo-2-naftil-ß-D-galactopiranósido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-ß-D-galactopiranósido (XGAL) ß-D- galactosidasa E coli 5-bromo-4-cloro-3-indolil-ß-D-glucurónido (XGLUC) 4-metilumberlliferil-ß-D-glucurónido (MUG) ß-D- glucuronidasa Enterococos 4-metilumberlliferil-ß-D-glucósido (MUD) indoxil-ß-D-glucósido ß-D- glucosidasa Fuente: Adaptado de Manafi (1996)