Desarrollo de RT-PCR para diagnóstico de Dengue y Chikungunya en México (DUPLEX). Dr. José Alberto Díaz Quiñonez Director General Adjunto de InDRE Dirección General de Epidemiología Subsecretaría de Prevención y Promoción de la Salud

Agenda Panorama Epidemiológico - Vigilancia Epidemiológica y Virológica de dengue en México (RNLSP) Algoritmo de dengue Técnicas diagnósticas para dengue qRT-PCR DUPLEX (Dengue/Chikungunya) Genotipificación (DENV Y CHIKV) Diagnóstico diferencial (ZIKA)

Panorama Epidemiológico de Dengue http://www.epidemiologia.salud.gob.mx/doctos/panodengue/PANORAMAS_2015/Pano_dengue_sem_33_2015.pdf

Panorama Epidemiológico de Dengue http://www.epidemiologia.salud.gob.mx/doctos/panodengue/PANORAMAS_2015/Pano_dengue_sem_33_2015.pdf

Panorama Epidemiológico de Dengue http://www.epidemiologia.salud.gob.mx/doctos/panodengue/PANORAMAS_2015/Pano_dengue_sem_33_2015.pdf

Panorama Epidemiológico de Dengue http://www.epidemiologia.salud.gob.mx/doctos/panodengue/PANORAMAS_2015/Pano_dengue_sem_33_2015.pdf

Panorama Epidemiológico de Dengue + - http://www.epidemiologia.salud.gob.mx/doctos/panodengue/PANORAMAS_2015/Pano_dengue_sem_33_2015.pdf

Panorama Epidemiológico de Dengue http://www.epidemiologia.salud.gob.mx/doctos/panodengue/PANORAMAS_2015/Pano_dengue_sem_33_2015.pdf

Vigilancia Virológica de Dengue Tipificación mediante RT-qPCR Serotipos de virus dengue identificados en la RNLSP http://www.epidemiologia.salud.gob.mx/doctos/panodengue/PANORAMAS_2015/Pano_dengue_sem_33_2015.pdf

Vigilancia Virológica de Dengue Tipificación mediante RT-qPCR Coordinación de Vigilancia Epidemiológica por Laboratorio Dirección de Diagnóstico y referencia / InDRE

Algoritmo de Diagnóstico por Laboratorio ELISA NS1 De 4 a 5 Días de Evolución IgM IgG NO SI NEG Para Vigilancia Virológica por RT-qPCR: Se deberán analizar el 10% de muestras positivas a NS1 de DNG y el 100% de DG Se confirma caso Con base en definición de caso Continuar con Dx diferencial FD: Chikungunya, ZIKA EFE´s FHD: Leptospirosis Ricketsiosis Fiebre amarilla ( en caso de viaje a zona endémica) POS Tiempo estándar de servicio 3 días de evolución Muestras de 0-5 días de iniciada la fiebre Muestras de ≥ 6 días de iniciada la fiebre Algoritmo completo y oportuno DGE/InDRE

Capacidad metodológica Para Dengue VIROLÓGICOS AISLAMIENTO VIRAL Células C6/36 BHK21 Vero INMUNOFLUORESCENCIA MOLECULARES RT- PCR punto final RT- PCR tiempo real Secuenciación SEROLÓGICOS ANTICUERPOS IgM IgG ANTÍGENO NS1 MNT DGE/InDRE Laboratorio de Arbovirus y Virus Hemorrágicos División Biología Molecular/Innovación y desarrollo División Serología

Capacidad Instalada en la RNLSP RNLSP con capacidad de Vigilancia Molecular en dos plataformas (CFX96 y 7500) - RT-qPCR RNLSP con capacidad de Vigilancia Serológica (ELISA de captura) Capacidad instalada en México. 100% para vigilancia serología (NS1, IgM e IgG) y molecular (RT-qPCR con detección multiple) Baja California y Tlaxcala no tienen implementado el RT-qPCR. Aguascalientes (amarillo) esta en fase de implementación por evidencia de circulación vectorial DGE/InDRE

Panel de Evaluación Externa del Desempeño en la RNLSP 2004 2006 2008 2012-1 2012-2 2013-1 2015-1 Panel exclusivo para serología (IgM e IgG) Envío anual Panel exclusivo para serología (IgM, IgG) Envío semestral Panel algorítmico y diferencial (IgM, IgG, NS1) y RT-qPCR DENV Y CHIKV) “SMART-ARBO” Panel exclusivo para serología (IgM, IgG) Se incluye NS1 Panel exclusivo para serología (PAN-SER-DEN) y Biología Molecular RT-qPCR por separado (NAT-DEN) Panel para Serología Algorítmico) y Biología Molecular RT-qPCR Por separado Panel algorítmico (IgM, IgG, NS1 y RT-qPCR) “SMART-DEN” DGE/InDRE Laboratorio de Arbovirus y Virus Hemorrágicos División Biología Molecular/Innovación y desarrollo División Serología

Paneles de Evaluación Externa del Desempeño PEED “SMART-ARBO” 2015-1 2012-2 “PAN-SER-DEN” (se incluye RT-qPCR y serología con NS1) 2004 (únicamente serología ) No. muestra Densidad óptica real Unidades Interpretación Observaciones 1 Overflow   Positivo IgM  2 IgM 3 4  IgG 5 0.161 2.8 Negativo  IgM e IgG 6 7 0.115 2.0 IgM e IgG  8 9  IgM 10 0.123 2.1 No. muestra Densidad óptica real Unidades Interpretación Observaciones 1 Overflow   Positivo NS1  2  IgM 3  IgG 4  IgG, IGM 5 0.161 2.8 Negativo IgM, IgG y NS1 6  NS1 7 0.115 2.0 8  IgM,NS1 9  IGM 10 0.123 2.1 IgM, IgG y NS1  DGE/InDRE Laboratorio de Arbovirus y Virus Hemorrágicos División Biología Molecular/Innovación y desarrollo División Serología

Paneles de Evaluación Externa del Desempeño PEED “SMART-ARBO” 2013-1 Panel algorítmico (IgM, IgG, NS1 y RT-qPCR) “SMART-DEN” No. de muestra Densidad Óptica LESP de técnicas aplicadas según algoritmo vigente Unidades o valor indice (si aplica según técnica) Valor de corte (calculado) Factor de corrección empleado (si aplica) Interpretación final del resultado LESP 1 NS1= 3.304 NA 0.615 POSITIVO a NS1 IgM= IgG= 2 NS1= 0.047 NEGATIVO a IgG IgM= 0.189 PANBIO 0.400 0.84 IgG= 0.137 PAMBIO 0.507 0.9 3 NS1= 0.033 POSITIVO a IgM IgM= 3.203 4 NS1=   IgM= 0.186 IgG= 0.140 5 IgM=3.245 6 NS1= 0.026 7 IgM= 3.222 8 NS1= 0.046 NEGATIVO IgG IgM= 0.169 IgG=0.151 9 IgM= 3.236 10 NS1= 3.281 11 NS1= 0.042 IgG=0.143 12 POSITIVO a IgG IgG=3.237 Número de muestra "X" a Valor de Cq inicial Valor de Cq 10-1 Valor de Cq 10-2 Valor de Cq 10-3 Valor de Cq 10-4 Interpretación (serotipo identificado) M1A - D1 19.39 22.49 26.16 29.41 34.26 DEN - 1 M1A - D2 13.38 15.7 20.36 25.45 DEN - 2 M10A - D1 20.58 23.63 26.87 31.24 35.23 M10A - D2 14.28 17.65 21.33 23.28 27.68 DGE/InDRE Laboratorio de Arbovirus y Virus Hemorrágicos División Biología Molecular/Innovación y desarrollo División Serología

Paneles de Evaluación Externa del Desempeño PEED “SMART-ARBO” 2015-1 ESTADO: BAJA CALIFORNIA SUR (GRUPO 1) DICTAMINACIÓN OBSERVACIONES No. MUESTRA 1 Correcta Aplica el algoritmo. Negativo a NS1, realiza IgG negativo (que aplica hacerlo, según algoritmo). 2 Incorrecta (determinación de IgM) se resta 0.5 por no detectarla. Detecta IgG Aplica algoritmo. Primera determinación negativa que en InDRE es positiva para IgM (BAJA DE 13.24). Confirma caso con IgG. Necesario checar lavados, tiempo de incubación y pipeteo. 3 Muestra rechazada por hemolisis. 4 Aplica el algoritmo. Negativo a NS1 y negativo a IgG en fase aguda. 5 Aplica algoritmo. Muestra NS1 positiva. Identifica DENV-1 6 Aplica algoritmo. Muestra NS1 positiva. Identifica DENV-4 7 Aplica algoritmo. Muestra negativa para IgM e IgG en fase convaleciente. 8 Aplica algoritmo. Negativa a NS1 y positiva a IgG. 9 10 Aplica algoritmo diferencial, negativo a dengue pasa a CHIK. CALIFICACION Serología 10.0 CALIFICACION Molecular CALIFICACIÓN FINAL Necesario checar pipeteo y lavado en muestras positivas bajas podemos identificar falsos negativos. No incluye proceso con muestras de rutina en PCR porque indica que se puede contaminar. Gráficos muy acostados poco definidos y con baja UFR. Checar en corto las sondas de DENV-1 y el protocolo. Muestra 1 PENDIENTE COEFICIENTE r2 -2.79027027 0.970818909 El panel diferencial para arbovirus incluye información epidemiológica, que permite al analista definir que metodología aplicará. Muestra 9 PENDIENTE COEFICIENTE r2 -2.841891892 0.96806097 NOTA: Se recomienda mantener la calidad en el pipeteo, esta es excelente. Se recomienda que la pendiente tenga un valor de -3.3 que corresponde a eficiencia de Reacción (E) del 100% . El Coeficiente r2 se recomienda que tenga un valor de 0.999.. que representa una linealidad muy considerable. Usted obtuvo una E= 84.55 % para DENV-1 y de 86.06% para DENV-4. Eficiencias de reacción bajas favorecen sensibilidad analítica baja promoviendo falso negativos. Eficiencias de reacción por encima del 100% favorecen falsos positivos. DGE/InDRE Laboratorio de Arbovirus y Virus Hemorrágicos División Biología Molecular/Innovación y desarrollo División Serología

Paneles de Evaluación Externa del Desempeño PEED “SMART- ARBO” 2015-1 ESTADO: MORELOS (GRUPO 2) DICTAMINACIÓN OBSERVACIONES 1 Correcta Aplica el algoritmo. Negativo a NS1, realiza IgG negativo (que aplica hacerlo, según algoritmo). 2 Incorrecta (determinación de IgM) se resta 0.5 por no detectarla. Detecta IgG Aplica algoritmo. Primera determinación negativa que en InDRE es positiva para IgM (BAJA DE 13.24). Confirma caso con IgG. Necesario checar lavados, tiempo de incubación y pipeteo. 3 Muestra rechazada por hemolisis. 4 Aplica el algoritmo. Negativo a NS1 y negativo a IgG en fase aguda. 5 Aplica algoritmo. Muestra NS1 positiva. Identifica DENV-1 6 Aplica algoritmo. Muestra NS1 positiva. Identifica DENV-4 7 Aplica algoritmo. Muestra negativa para IgM e IgG en fase convaleciente. 8 Aplica algoritmo. Negativa a NS1 y positiva a IgG. 9 10 Aplica algoritmo diferencial, negativo a dengue pasa a CHIK. Detecta por RT-PCR positivo a CHIK. CALIFICACION Serología 9.5 CALIFICACION Molecular CALIFICACIÓN FINAL Necesario checar pipeteo y lavado en muestras positivas bajas podemos identificar falsos negativos. Incluye muestras en procesos de rutina. Muestras positivas a dengue pasa el porcentaje a chikungnya para identificar coinfecciones. Maneja las detecciones de dengue en 7500 y de CHIKV en CFX96. Realiza diluciones a todas las muestras positivas por PCR. Envía formatos de corridas. Muestra 5 Diagnóstico diferencial. Muestras negativas a dengue pero positivas a Chikungunya. PENDIENTE COEFICIENTE r2 -2.759594595 0.935188939 Muestra 10 PENDIENTE COEFICIENTE r2 -2.815135135 0.956266137 DGE/InDRE Laboratorio de Arbovirus y Virus Hemorrágicos División Biología Molecular/Innovación y desarrollo División Serología

Paneles de Evaluación Externa del Desempeño Internacional - CDC 100% de concordancia en Biología Molecular (RT-qPCR) y Serología (MAC ELISA) DGE/InDRE Laboratorio de Arbovirus y Virus Hemorrágicos División Biología Molecular/Innovación y desarrollo División Serología

Paneles de Evaluación Externa del Desempeño Internacional - ENIVD Análisis serológico MAC ELISA, ELISA Comercial InBIOS Análisis Molecular qRT-PCR y qRT-PCR “DUPLEX” Próximo envío de resultados el 4 de septiembre DGE/InDRE Laboratorio de Arbovirus y Virus Hemorrágicos División Biología Molecular/Innovación y desarrollo División Serología

Genotipificación de DENV Americano /africano Pacifico Sur Asiático DENV-2 Cosmopolita Asiático América/Asia DGE/InDRE Laboratorio de Arbovirus y Virus Hemorrágicos División Biología Molecular/Innovación y desarrollo

Genotipificación de DENV Genotipo I Genotipo III Genotipo II Genotipo II Genotipo IV DGE/InDRE Laboratorio de Arbovirus y Virus Hemorrágicos División Biología Molecular/Innovación y desarrollo

Distribución de Genotipos Jalisco DENV-2 Asiático-Americano Morelos Nuevo León DENV-4 GEN-II Tabasco DENV-1 Asiático Quintana Roo DENV-3 GEN-III Veracruz DENV-1 Asiático DGE/InDRE Laboratorio de Arbovirus y Virus Hemorrágicos División Biología Molecular/Innovación y desarrollo

CRONOLOGÍA DEL INGRESO DE LOS CUATRO SEROTIPOS DEL VIRUS DENGUE EN MÉXICO DENV-2 ASIATICO/AMERICANO 2014 DENV-4 GEN-II DENV-3 GEN-III DG ?? DG DGE/InDRE Laboratorio de Arbovirus y Virus Hemorrágicos División Biología Molecular/Innovación y desarrollo

Genotipificación de CHIKV EU703760.1 Malaysia 2006 HM045797.1 Indonesia 1985 HM045789.1 Thailand 1988 HM045814.1 Thailand 1975 FJ807897.1 Indonesia 2007 HM045808.1 Thailand 1978 EU703759.1 Malaysia 2006 HM045791.1 Indonesia 1983 HM045790.1 Philippines 1985 MEX Jalisco 2014 - Cultivo KJ451622.1 YAP 2013 KJ451624.1 British Virgin Islands 2014 KC488650.1 Philippines 2012 KF318729.1 China Zhejiang 2012 MEX Coahuila 2014 - Cultivo MEX Chiapas 2014 - Muestra HM045796.1 Thailand 1995 HE806461.1 New Caledonia:2011 HM045810.1 Thailand 1958 HM045803.1 India 1963 HM045813.1 India 1963 HM045788.1 India 1973 HM045809.1 DR Congo 1960 HM045784.1 Central African Republic 1984 HM045812.1 Uganda 1982 HM045822.1 Central African Republic 1978 HM045823.1 Angola 1962 JF274082.1 India 2006 EU244823.2 Italy 2007 GU189061.1 Sri Lanka 2006 HQ456251.1 Comoros 2005 FJ445510.2 Singapore 2008 AF490259.3 Tanzania 1953 HM045786.1 Nigeria 1974 HM045818.1 Ivory Coast 1981 AY726732.1 Senegal 1983 90 100 82 99 67 95 97 66 73 62 0.02 Asiático East/Central/South African (ECSA) West African DGE/InDRE Laboratorio de Arbovirus y Virus Hemorrágicos División Biología Molecular/Innovación y desarrollo

Protocolo dúplex DENV/CHIKV Una mezcla de reacción Mismo protocolo de amplificación para ambos virus Se identifican simultáneamente co-infecciones con DENV(serotipo)/CHIKV Optimización de reactivos (enzima) e insumos Aplicado a muestras de humanos y moscos. Protocolo de Amplificación Curvas de Amplificación DGE/InDRE Laboratorio de Arbovirus y Virus Hemorrágicos División Biología Molecular/Innovación y desarrollo

Protocolo dúplex DENV/CHIKV CHIKV/DENV1, 2, 3, 4 DENV1/CHIKV DENV2/CHIKV CHIKV DENV3/CHIKV DENV4/CHIKV NEGATIVO DGE/InDRE Laboratorio de Arbovirus y Virus Hemorrágicos División Biología Molecular/Innovación y desarrollo

Inclusión del RP(control interno) en la reacción de RT-qPCR para detección de Virus Chikungunya CHIKV-RP CHIKV-RP Escala lineal Escala logarítmica CHIKV RP DGE/InDRE Laboratorio de Arbovirus y Virus Hemorrágicos División Biología Molecular/Innovación y desarrollo

Kit RT-qPCR Dengue - CDC Implementación a toda la RNLSP Primer envío por CDC Atlanta, en septiembre Capacitación a la RNLSP a finales del 2015 DGE/InDRE Laboratorio de Arbovirus y Virus Hemorrágicos División Biología Molecular/Innovación y desarrollo

Applied 7500 Validado en InDRE para uso en dos plataformas de amplificación (Applied 7500 y CFX96) Kit RT-qPCR Dengue - CDC Applied 7500 Cuatro serotipos y RP RP DENV-1 DENV-2 DENV-3 DENV-4 DGE/InDRE Laboratorio de Arbovirus y Virus Hemorrágicos División Biología Molecular/Innovación y desarrollo

CFX96 Validado en InDRE para uso en dos plataformas de amplificación (Applied 7500 y CFX96) Kit RT-qPCR Dengue - CDC CFX96 DENV-1 DENV-2 DENV-3 DENV-4 DGE/InDRE Laboratorio de Arbovirus y Virus Hemorrágicos División Biología Molecular/Innovación y desarrollo

Vigilancia Entomo-virologica El éxito y los resultados provienen del trabajo en Conjunto y multidisciplinario ENTOMOLÓGICA VIROLÓGICA DGE/InDRE Laboratorio de Arbovirus y Virus Hemorrágicos División Biología Molecular/Innovación y desarrollo

Vigilancia Entomo-virologica Serotipos identificados: DENV-1 y DENV-2 2012.- Detección de DENV-4 en moscos antes de que se detectaran los casos en humanos 2013.- Detección de DENV-4 en humanos GUERRERO Aislamiento viral Detección de antígeno NS1 Detección molecular Biol. DGE/InDRE Laboratorio de Arbovirus y Virus Hemorrágicos División Biología Molecular/Innovación y desarrollo División Serología

Vigilancia Entomo-virologica MORELOS Jojutla Axochiapan Tepalcingo Yautepec Te mi xco Tlaquiltenango A F E B D C Estado de México Distrito Federal Estado de México Guerrero Puebla DENV-1 mosquitos coincide con el identificado en humanos: Detectado periodo baja actividad de Dengue. En 2103 detección de DENV-2 Jalisco C B Sinaloa Nayarit Zacatecas Aguascalientes Colima Michoacán A DENV-2 circulando en humanos. DENV-4 serotipo no identificado en humanos. DETECTADOS ANTICIPADAMENTE Detección de Transmisión transovarica!! Quintana Roo Quintana Roo Cozumel DETECTADOS DURANTE UN BROTE. DENV-2: detectado en humanos. DENV-1: no identificado en humanos. Municipio No. De grupo Serotipo identificado por RT-PCR Fourplex en tiempo real Puerto Vallarta 16 DENV-2 3 DENV-2/DENV-4 2 DENV-4 Localidad de captura. Serotipo identificado por RT-PCR Fourplex en tiempo real Col. Repobladores DENV-2 Col. Emiliano Zapata DENV-1/DENV-2 DENV-1 Municipio Especie Serotipo identificado por RT-qPCR Jojutla A.   aegypti♀ DENV-1 Biol. DGE/InDRE Laboratorio de Arbovirus y Virus Hemorrágicos División Biología Molecular/Innovación y desarrollo

Resultados de la vigilancia entomo-virológica 2014 CHIKUNGUNYA ESTADO LOCALIDAD MUNICIPIO RESULTADO Chiapas Tuxtla Gutiérrez Positivo La Libertad Suchiate Rayón Tuxtla Chico Año ESTADO NO. DE GRUPOS RESULTADO 2014 Chiapas 36 10 POSITIVOS A CHIK Durango 1 NEGATIVO Guanajuato Guerrero 8 8 POSITIVOS A CHIK Jalisco 43 Michoacán 33 Morelos 3 NEGATIVOS, 4 DENV-1, 1 DENV-4 Nuevo León 3 Tamaulipas 22 Veracruz 10 TOTAL 165 CHIKUNGUNYA ESTADO LOCALIDAD RESULTADO Guerrero Vicente Guerrero Positivo (29.30) Vista Hermosa Positivo (26.84) Niños Héroes Positivo (27.68) Libertad Positivo (21.66) Juchitán Positivo (33.90)  Sin dato Positivo (17.37) Positivo (34.60) Positivo (18.05) DGE/InDRE Laboratorio de Arbovirus y Virus Hemorragicos División Biología Molecular/Innovación y desarrollo

Resultados de la vigilancia entomo-virológica 2015 Necesario intensificar la vigilancia entomo virologica Aprovechar la ventaja de esta vigilancia. AÑO ESTADO NO. DE GRUPOS RESULTADO 2015 Chiapas 28 22 NEGATIVO Y 6 POSITIVOS Morelos Amacuzac (Teacalco) 41 1 POSITIVO A DENV-1 Tabasco 5 NEGATIVO Veracruz 1 Guerrero 17 14 POSITIVOS CHIK, 3 NEGATIVOS TOTAL 92 Búsqueda anticipada y preventiva ZIKA DGE/InDRE Laboratorio de Arbovirus y Virus Hemorrágicos División Biología Molecular/Innovación y desarrollo

Evaluaciones para biología molecular y serología DGE/InDRE Laboratorio de Arbovirus y Virus Hemorrágicos División Biología Molecular/Innovación y desarrollo División Serología

Evaluaciones para biología molecular y serología DGE/InDRE Laboratorio de Arbovirus y Virus Hemorrágicos División Biología Molecular/Innovación y desarrollo División Serología

Diagnóstico diferencial RT-PCR y RT-qPCR SYBR Green - ZIKA Ante la ausencia de sondas especifica: Identificación de especificidad mediante experimento de “High Resolution Melting” (HRM) Curvas de Disociación (Control positivo) Curvas de Disociación (Control Negativo) Curvas de disociación del control Negativo Curvas de disociación del Control positivo) Curvas del Control positivo (Duplicado) Control Negativo Control Positivo Escala logarítmica Curvas del Control positivo) Curvas del Control positivo (Duplicado) Curvas del Control negativo) Escala lineal DGE/InDRE Laboratorio de Arbovirus y Virus Hemorrágicos División Biología Molecular/Innovación y desarrollo

Laboratorio certificado y Acreditado Por algoritmo de diagnóstico Certificación ISO 9001:2008 Acreditación ISO 15189, por la Entidad Mexicana de Acreditación (EMA) Detección de Antígeno NS1 Detección de anticuerpos IgM (ELISA de captura) Detección de Anticuerpos IgG (ELISA de captura) Detección de RNA de virus dengue mediante RT-qPR “Multiplex” Detección de RNA de virus dengue mediante RT-qPCR “Fourplex” DGE/InDRE Laboratorio de Arbovirus y Virus Hemorrágicos División Biología Molecular/Innovación y desarroll División Serología o

Laboratorio de Arbovirus y virus hemorrágicos QFB. Alma Núñez León QFP. Rosalba Pérez Meza QFB. Yanelli Adriana Torres Olmos QFB. Claudia Rosales Jiménez T.L. Adela Monserrat Aparicio Antonio Apoyo Admvo. Rosa María Herrera Bautista M. en C. María de la Luz Torres Rodríguez M. En C. Mauricio Vázquez Pichardo DGE/InDRE Laboratorio de Arbovirus y Virus Hemorrágicos División Biología Molecular/Innovación y desarrollo División de serología