TAXONOMÍA Y EVOLUCIÓN BACTERIANA

Principales Procariotas Fitopatógenos - BACTERIAS Pared celular Cultivables “in vitro” - BACTERIAS VASCULARES Pared celular ondulada Cultivables “in vitro” con dificultad Viven en el xilema Se transmiten por Insectos - MICOORGANISMOS SEMEJANTES A BACTERIAS No se pueden cultivar “in vitro” Viven en el floema y/o en el xilema - ACTINOMICETOS Pared celular Cultivables “in vitro” Forman “micelio” MOLICUTES Carecen de pared celular Viven en el floema Se transmiten por Insectos Sensibles a las Tetraciclinas * ESPIROPLASMAS Espiral * FITOPLASMAS No se pueden cultivar “in vitro” Esféricos, pleomóficos

TAXONOMÍA Clasificación Nomenclatura Identificación estructura los organismos en grupos (taxones) en base a su similitud Nomenclatura asigna nombres a los taxones Identificación determina a que taxones pertenece un organismo que se aisla

Taxonomía Identificación Caracterización exhaustiva Aplicación de teoría y método de clasificación Formación de grupos taxonómicos (taxones) Nomenclatura Identificación Caracterización por número limitado de tests adecuados al problema Comparación con spp conocidas Asignación a una sp No identificado: estudio taxonómico

ESPECIE unidad taxonómica básica grupo de cepas que tiene un alto grado de similitud en sus propiedades y que difieren en forma significativa de otros grupos de cepas Cepa: población de organismos que desciende de un único organismo

ESPECIE BACTERIANA Concepto en revisión continua Definición metodológica estándar: - % de hibridación ADN1-ADN2 > 70% - ΔTm < 5ºC (estabilidad térmica del híbrido ADN1-ADN2) Actualmente el criterio es POLIFÁSICO (combinación de características fenotípicas y genómicas)

Aumento de absorbancia del ADN a 260nm por desnaturalizacion Longitud de onda (nm) ADN simple hebra ADN doble hebra Absorbancia 220 260 300 Aumento de absorbancia del ADN a 260nm por desnaturalizacion Abs. relativa 260 nm 80 90 100 temperatura (ºC) Tm = 86ºC ADN doble hebra ADN simple hebra desnaturalización Tm: punto medio del perfil de desnaturalización térmica de ADN-ADN o de ADN-ARN

Ensayo de reasociación de ADN-ADN para cepas a y b

Curvas de desnaturalización térmica de ADN homoduplex y heteroduplex

RANGOS TAXONOMICOS EN CLASIFICACION BACTERIANA Taxones: Dominio Phylum Clase Orden Familia Género Especie Sub-especie importancia en estudios clínicos y ecológicos

Sistema binomial de nomenclatura (Linneo) Escherichia coli Escherichia coli o E. coli

Phylum Clase Orden Familia Genero Especie Bacteria Proteobacteria Dominio Phylum Clase Orden Familia Genero Especie Bacteria Proteobacteria Gamma Proteobacteria Zymobacteria Enterobacteriales Enterobacteriaceae Escherichia Escherichia coli

Categorías de clasificacion a nivel de sub-especie (tipificación) Variedades o tipos serovariedad o serotipo (antígenos distintos) fagovariedad (tipificación por fagos) biovariedad (diferencias bioquímicas y fisiológicas) patovariedad (patogenicidad) morfovariedad (diferencias morfológicas) genomovariedad (grupos con ADN similares)

Bergey´s Manual of Determinative Bacteriology 1923 (1ed)-1994 (9ed) Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology 1a Ed 1984(vol 1)-1989(vol 4) Bergey´s manual of Systematic Bacteriology 2a Ed 2001(vol 1) The Prokaryotes (http:/www.prokaryotes.com)

COLECCIONES (cepas tipo y otras) PUBLICACIONES International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (antes IJSB). Publicado por la Sociedad General de Microbiología Otros: Applied and Environmental Microbiology, Systematic Applied Microbiology COLECCIONES (cepas tipo y otras) ATCC (American Type Culture Collection) DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelkulturen, Colección alemana) CIP (Colección del Instituto Pasteur, Francia)

Taxonomía bacteriana CLÁSICA caracteres fenotípicos (morfología, nutrición, etc.) algunos genotípicos: % G+C, hibridación ADN-ADN ponderación de caracteres (llaves dicotómicas)

Características fenotípicas clásicas de valor taxonómico Morfología: forma, tamaño y tinción Nutrición y fisiología: fotótrofo, quimiótrofo, aerobio o anaerobio, temperatura y pH óptimos, fuentes alternativas de C, N y S Movilidad: tipo y disposición de flagelos Otros: pigmentos, inclusiones celulares, sensibilidad a antibióticos, patogenicidad

Características genotípicas clásicas Contenido G+C % G+C = G + C x 100 G + C + A + T determinación por gradiente de CsCl, desnaturalización térmica o cromatografía Amplio rango en procariotas: 20 al 80% Poca información para la caracterización taxonómica criterio de exclusión: %GC > 3, probablemente especies diferentes %GC > 10, probablemente géneros diferentes

- depende de la secuencia completa del genoma Hibridación ADN-ADN - depende de la secuencia completa del genoma - útil en organismos estrechamente relacionados - determinación por: % hibridación de ADN1 - ADN2 Δ Tm del híbrido - es el criterio actual de definición de especie

NUMÉRICA Agrupación de unidades taxonómicas o taxones por métodos numéricos Se basa en un gran número de caracteres Cada carácter tiene igual peso La similitud es función de la proporción de caracteres comunes

- caracteres fenotípicos (no menos de 60) NUMÉRICA - caracteres fenotípicos (no menos de 60) - coeficiente de semejanza = a + d . a + b + c + d a: número de caracteres positivos en ambas cepas b: número de caracteres positivos sólo en cepa 1 c: número de caracteres positivos sólo en cepa 2 d: número de caracteres negativos en ambas cepas

Desventajas de una clasificación artificial No permite inferir propiedades No permite comprender microorganismos que no se han cultivado en el laboratorio No permite estudiar el origen y evolución de funciones celulares (resistencia a antibióticos, aerobiosis, fotosintesis)

Clasificación natural Estructura los organismos en taxones cuyos miembros reflejan tanto como sea posible su naturaleza biológica. Es ventajosa si además establece relaciones evolutivas

POLIFÁSICA Es la tendencia moderna. Consenso en la integración de distintos tipos de caracteres: Fenotípicos: - clásicos (morfología, nutrición, etc) - marcadores quimiotaxonómicos - perfil de proteínas totales y enzimas Genotípicos: clásicos: % G+C hibridación DNA-DNA nuevos: fingerprinting (ej. perfiles moleculares por restricción o amplificación de ADN) Filogenéticos: basados en el gen del ARNr 16S

Esquema de las técnicas e información más frecuente empleadas en la taxonomía polifásica (Vandamme et al., 1996).

CARACTERES FENOTIPICOS Marcadores quimiotaxonómicos Características análisis químico con equipamiento especializado no son universales, muy útiles dentro de algunos grupos alto grado de discriminación presentes en distintas estructuras celulares

Pared: peptidoglicanos en todas las bacterias salvo en Planctomyces y Mycoplamas Membrana externa Gram negativos: lipopolisacáridos Membrana citoplasmática: acidos grasos (Fatty Acid Methyl Ester), ácidos micólicos en un grupo de bacterias Gram positivas (Actinomicetes), pigmentos carotenoides en bacterias fotótrofas anoxigénicas. Cadena de transporte electrónico: citocromos, quinonas. Sistema fotosintético: bacterioclorofilas. Citoplasma: poliaminas en metanogénicas y Gram negativas

CARACTERES FILOGENETICOS Plantean hipótesis de evolución (determina relaciones de parentesco entre las especies) Compara la secuencia de moléculas (cronómetros evolutivos) y establece la relación entre ellas Las secuencias de las moléculas son el registro histórico de la evolución

distribución universal (presente en todos los organismos) PROPIEDADES DE UN BUEN CRONÓMETRO EVOLUTIVO distribución universal (presente en todos los organismos) función homóloga en todos los organismos secuencias con zonas altamente conservada para distancias evolutivas grandes (alineamiento) y algunas zonas variables ausencia de transferencia horizontal cantidad de informacion suficiente

Moléculas usadas para la determinación de relaciones filogenéticas de organismos ARNr: 5S, 16S y 23S (Carl Woese) Factor de Elongación Tu Subunidad beta de ATPasa RecA Genes funcionales

ARNr en Procariotas Nombre Tamaño Ubicación (nucleótidos) 5S 120 Subunidad mayor del ribosoma 16S 1500 Subunidad menor 23S 2900 Subunidad mayor

Arboles filogéneticos

Arboles filogenéticos Uso de programas para alinear secuencias y construir árboles filogenéticos Longitud de la línea entre organismos es proporcional a la distancia evolutiva Similitud de secuencias implica similitud en los genes

Ejemplo de un árbol filogenético basado en el gen ARNr 16S Ejemplo de un árbol filogenético basado en el gen ARNr 16S. La barra indica la sustitución de 10 nucleótidos cada 100

Estructura secundaria: Secuencia del ARNr 16S Estructura primaria: Dominios de conservación universal Regiones altamente variables Dominios de nivel intermedio de conservación, con cambios de secuencia, pero conservación de estructura secundaria Estructura secundaria: Similar en todos los organismos Acotada por su función en la síntesis de proteínas: función ancestral

Estructura secundaria del ARNr 16S de E. coli Líneas gruesas: dominios de conservación universal Líneas normales: dominios de conservación intermedia Líneas punteadas: regiones hipervariables

ARBOL FILOGENETICO UNIVERSAL

Características diferenciales entre Bacteria, Archaea y Eukarya

Secuencias signaturas o firma en ARNr Oligonucleótidos o bases presentes en determinadas posiciones en ciertos grupos de organismos Ejemplos: AAACUCAAA (posición 910) en Bacteria CACACACCG (posición 1400) en Archaea C (posición 47) en gamma-Protebacteria, Cianobacteria, Bacteroides, Grampositivos

Arbol del ARNr 16S Termofilia representada en los grupos mas profundos de Archaea y Bacteria Muchos de los linajes profundos son anerobios o microaerofílicos Fotosíntesis basada en clorofilas: distribuida en varios linajes de Bacteria

Termofilia en todos los miembros de la rama Termofilia en algunos miembros de la rama

Propiedades definidas genéticamente que han cambiado poco Estructura de la pared celular: peptidoglicano solo presente en Bacteria Gram +: linaje filogenéticamente coherente Lípidos de membrana (ésteres o éteres) Metanogénicos: todos pertenecen a uno de los 4 linajes dentro de Archaea

Caracteres que confirman el árbol universal construido a partir del ARNr 16S Principales diferencias entre dominios Bacteria, Archaea y Eukarya Procariotas actuales mas cercanos al ancestro relacionadas con las condiciones fisicoquímicas en el origen de la vida: Aquifex y Methanopyrus (termofilia, anaerobiosis) Características de los Eukarya mas cercanos a los procariotas: Giardia y Microsporidia Secuencias de otras moléculas, especialmente las ligadas a la replicacion, transcripción y traducción

Microsporidia y Giardia: carecen de mitocondria, son parásitos obligados, tienen genoma un poco mayor que los procariotas.

Caracteres similares en taxones filogenéticamente distantes Chloroflexus y Chlorobium ambos poseen clorosomas con similar función y estructura, pero diferentes centros de reacción posibles explicaciones: transferencia lateral evolución independiente el gen del ARNr 16S aportaría información limitada

Arbol del dominio Bacteria

DOMINIO BACTERIA Actualmente con mas de 40 divisiones (phylum), algunas sin organismos cultivados (secuencias ambientales) Phylum mejores caracterizados: Proteobacteria (α,β,γ,δ,ε), Gram positivos (LowGC y HighGC) Origen de mitocondrias (phylum Proteobacteria) y cloroplastos (phylum Cyanobacteria)

Relación entre la definición de especie bacteriana y el análisis del gen ARNr 16S Definición especie: % de hibridación ADN1-ADN2 > 70% En general se cumple: secuencia del gen del ARNr 16S difiere en mas del 3% con el resto de las secuencias conocidas de bacterias entonces el % de hibridación ADN-ADN es menor al 70% especies diferentes

Secuencia del gen ARNr 16S Se emplea frecuentemente para: COMPLETAR IDENTIFICACIÓN DE CULTIVOS PUROS ANÁLISIS DE COMUNIDADES SIN CULTIVO

ANÁLISIS DE LA SECUENCIA DEL GEN ARNr 16S PARA LA IDENTIFICACIÓN DE UNA CEPA BACTERIANA > 3% < 3% Diferencia de secuencia con la cepa mas similar Alineamiento y corrección de la secuencia Comparación con bases de secuencias (http://rdp.cme.msu.edu/html http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank) NUEVA CEPA DE LA MISMA ESPECIE < 70% Hibridación ADN-ADN pruebas fenotípicas similares diferentes > 70% Confirmación con pruebas fenotípicas y genotípicas diferentes NUEVA ESPECIE

¿Por qué hay tanta diversidad entre los Procariotas (Archaea y Bacteria)? son ancestrales son ubicuos: ambientes extremos, parásitos o simbiontes de Eukarya representan la mayor diversidad de seres vivos, mucha de la cual esta aún inexplorada

Ejemplos de diversidad: estructura y función Pared: bacterias sin pared (Mycoplasmas, Thermoplasmas) Membranas: diferente composición (Mycobacterium) Forma: Espiroquetas, bacterias con prostecas (Caulobacter), formacion de hifas (Streptomyces) Mecanismos de movimiento: bacterias deslizantes (Beggiatoa) Diferenciacion celular: microcistos de Cyanobacterias, comportamiento social (Myxobacterias) Comportamiento frente a otras bacterias: predación (Bdellovibrio) Obtención de energía independiente del trasporte de electrones (fosforilación oxidativa o fotosíntesis) y la fermentación, ej.decarboxilasas en Oxalobacter formigenes

ORIGEN DE LA VIDA Origen de la tierra 4600 millones de años Condiciones de la Tierra primitiva: CH4, CO2, N2 NH3 y muy poco O2 (ambiente reductor). Trazas de FeS y H2S Temperatura > 100°C Evidencia de vida microbiana en la Tierra primitiva (microfósiles: estromatolitos) Vida primitiva: ¿organismos con ARN? (sin ADN) Célula moderna: ADN ARN Proteína Origen de eucariotas: teoría endosimbiótica