Los resultados obtenidos mediante PCR-DGGE muestran diversos patrones de comunidades bacterianas entre individuos, que se mantienen estables e independientes del consumo moderado de vino. La cuantificación de bacterias totales mediante q-PCR se mantiene constante tras el consumo moderado de vino, sin embargo, los géneros Streptococcus, Neisseria y Actynomices muestran diferencias significativas en la proporción relativa frente a los voluntarios que no consumieron vino. La cavidad bucal está compuesta por cientos de especies de microorganismos diferentes, siendo en su mayoría bacterias, aunque aproximadamente sólo el 50% de estas especies se pueden cultivar. Diversos estudios han demostrado que existe un efecto entre los componentes del vino y la salud bucal, sin embargo, apenas existe información acerca de la modulación bacteriana por parte de los polifenoles del vino en la cavidad bucal. El objetivo de este trabajo ha sido estudiar los posibles efectos del consumo moderado de vino tinto sobre la microbiota de la cavidad bucal a través de un estudio de intervención en humanos. A partir del ADN de las muestras de saliva obtenidas de un grupo de individuos sanos que habían estado consumiendo vino de forma moderada durante 28 días, se realizaron análisis de la población microbiana a través de la separación de los fragmentos amplificados por PCR mediante electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE), así como la cuantificación relativa de las diferentes poblaciones bacterianas por PCR cuantitativa (q-PCR). EFECTO DEL CONSUMO MODERADO DE VINO SOBRE LA MICROBIOTA DE LA CAVIDAD BUCAL Raquel Tabasco, Elvira Barroso, Tomás García-Cayuela, Irene Muñoz, M. Victoria Moreno-Arribas, Begoña Bartolomé, M. Carmen Martínez-Cuesta, Carmen Peláez y Teresa Requena Departamento de Biotecnología y Microbiología de Alimentos. Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación, CIAL (CSIC-UAM). Nicolás Cabrera, 9. Campus de Cantoblanco, Madrid. EFECTO DEL CONSUMO MODERADO DE VINO SOBRE LA MICROBIOTA DE LA CAVIDAD BUCAL Raquel Tabasco, Elvira Barroso, Tomás García-Cayuela, Irene Muñoz, M. Victoria Moreno-Arribas, Begoña Bartolomé, M. Carmen Martínez-Cuesta, Carmen Peláez y Teresa Requena Departamento de Biotecnología y Microbiología de Alimentos. Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación, CIAL (CSIC-UAM). Nicolás Cabrera, 9. Campus de Cantoblanco, Madrid. Este trabajo ha sido financiado por el Ministerio de Ciencia e Innovación (proyectos AGL C02-00 y CSD Consolider Ingenio 2010 FUN-C-FOOD), la Comunidad de Madrid (proyecto ALIBIRD P2009/AGR-1469) y CYTED (IBEROFUN 110AC0386). Raquel Tabasco agradece al Instituto Danone la concesión de una beca de investigación. RESULTADOS Tabla 1. Lista de cebadores para DGGE utilizados en este estudio. Tabla 2. Lista de cebadores empleados en el estudio y eficiencias obtenidas con cada pareja de cebadores Perfiles microbianos de saliva obtenidos por PCR- DGGE Fig.1. PCR-DGGE con cebadores de bacterias totales Carriles 1, 2, 3 y 8: antes (a) y después (d) del periodo de consumo moderado de vino. Carriles 4, 5, 6 y 7: controles (no consumidores de vino) Fig.1. PCR-DGGE con cebadores de bacterias totales Carriles 1, 2, 3 y 8: antes (a) y después (d) del periodo de consumo moderado de vino. Carriles 4, 5, 6 y 7: controles (no consumidores de vino) Los perfiles microbianos de la saliva de los individuos antes y después del consumo moderado de vino, obtenidos por PCR-DGGE, no mostraron relación entre el consumo de vino y los perfiles de bandas. Las diferencias encontradas indican mayor variabilidad entre individuos que la que podría asociarse al consumo de vino. Fig.2. PCR-DGGE con cebadores específicos para Streptococcus. Se observa una banda mayoritaria y presente en todos los individuos, cuya secuenciación permitió su identificación como S. mitis - S. oralis, que se corresponde con estreptococos del grupo viridans, predominantes en la cavidad bucal. Fig.2. PCR-DGGE con cebadores específicos para Streptococcus. Se observa una banda mayoritaria y presente en todos los individuos, cuya secuenciación permitió su identificación como S. mitis - S. oralis, que se corresponde con estreptococos del grupo viridans, predominantes en la cavidad bucal. Cuantificación de la microbiota bucal mediante q-PCR Fig.3. PCR-DGGE específicas para Veillonella El perfil de bandas obtenido para Veillonella muestra una mayor diversidad bacteriana, al igual que se observó en Prevotella, Porphiromonas, Bacteroides y Neisseria, géneros mayoritarios en la cavidad bucal. Fig.3. PCR-DGGE específicas para Veillonella El perfil de bandas obtenido para Veillonella muestra una mayor diversidad bacteriana, al igual que se observó en Prevotella, Porphiromonas, Bacteroides y Neisseria, géneros mayoritarios en la cavidad bucal. Voluntarios Log ufc/ml ± desv. est INICIO Log ufc/ml ± desv. est FINAL Consumidores vino8,37 ± 1,098,40 ± 1,56 Voluntarios controles7,92 ± 1,167,70 ± 0,81 Tabla 3. Resultados obtenidos de la cuantificación de bacterias totales en saliva, empleando cebadores universales y una recta de calibrado con diluciones decimales de ADN de un cultivo puro de E. coli (Eficiencia = 93,3%, r 2 = 0,995, slope= -3,493). Los resultados estadísticos (Student- t) no mostraron diferencias significativas en el número total de bacterias de la saliva debido al consumo moderado de vino. Controles Consumidores de vino Consumidores de vino ND: no detectado D.E.: Desviación estándar Tabla 4. Resultados obtenidos de los ratios relativos de cada especie después de los 28 días de estudio en ambos grupos de voluntarios. La cuantificación relativa se calculó de acuerdo al método de Pftaffl et al. (2002). Los resultados del análisis por q-PCR de los géneros bacterianos, antes y después del consumo de vino, mostraron diferencias en la proporción relativa de Streptococcus (P=0,042), Neisseria (P=0,003) y Actynomices (P=0,003), asociadas al consumo moderado de vino. ESTUDIO DE INTERVENCIÓN Individuos sanos de ambos sexos Edad: años No fumadores Sin tomar antibióticos en 6 meses Periodo de lavado (15 días) Periodo de consumo de vino (250 ml/día) durante 28 días ESTUDIO DE INTERVENCIÓN Individuos sanos de ambos sexos Edad: años No fumadores Sin tomar antibióticos en 6 meses Periodo de lavado (15 días) Periodo de consumo de vino (250 ml/día) durante 28 días MUESTRA DE SALIVA MUESTRA DE SALIVA Recogida de muestras: Enjuague bucal con 15 ml de agua Centrifugación y recuperación del sedimento celular. Extracción del ADN genómico total: Rotura mecánica con bolas de vidrio Incubación a 70 ºC con buffer de lisis Kit NucleoSpin® Tissue Recogida de muestras: Enjuague bucal con 15 ml de agua Centrifugación y recuperación del sedimento celular. Extracción del ADN genómico total: Rotura mecánica con bolas de vidrio Incubación a 70 ºC con buffer de lisis Kit NucleoSpin® Tissue CONCLUSIONES MATERIALES Y MÉTODOS INTRODUCCIÓN Y OBJETIVO