Métodos hidrodinámicos Técnicas que involucran el transporte, movimiento, de macromoléculas biológicas en un fluído (agua) Sedimentación (velocidad y equilibrio) Electroforesis (nativa y desnaturalizante) Gel filtración, SEC Dispersión de luz, light scattering (clásica y dinámica) Obtenemos información de estructura cuaternaria, peso molecular, composición de subunidades, agregados, forma, grado de solvatación

SEDIMENTACIÓN Transporte de una partícula en solución sometida a una fuerza (gravitacional o centrífuga) Para sedimentar una partícula sólo por acción de la gravedad, deben ser partículas grandes. Para separar macromoléculas biológicas en suspensión por sedimentación debemos usar fuerza centrífuga (CENTRIFUGACIÓN) Y aceleraciones altas!

Particula en suspensión en medio fluído, en tubo de centrífuga, contenido en un rotor, que gira alrededor de su eje A a una velocidad angular ω, rad/s (=2π/60 rpm) Simplificando, podemos decir que la partícula está sometida a 3 fuerzas: Fc =fuerza centrífuga Fb = fuerza de empuje Ff = fuerza de friccción

Fc = m ω2 r m = masa partícula ω = vel. angular rotor r = radio rotor Fb = mo ω2 r mo = masa del solvente desplazado mo = m ν ρ ρ = densidad del solvente ν = volúmen específico parcial Ff = f v f = coeficiente de fricción v = velocidad de la partícula La partícula alcanza una velocidad constante (v) cuando la fuerza neta es cero: Fc + Fb + Ff = 0

VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN (v) v = ω2 r m (1 - ν ρ) f Definimos COEFICIENTE DE SEDIMENTACIÓN (S): S = v = m (1 - ν ρ) ω2 r f Multiplicando por el número de Avogadro N: m N = M (peso molecular) S = M (1 - ν ρ) N f M = peso molecular (1- ν ρ) = factor de empuje f = coeficiente de fricción

Relación entre coeficiente de sedimentación S y coeficiente de difusión D S = M (1 - ν ρ) N f D = coeficiente de difusión: D = k T/f = R T/N f S = D M (1 - ν ρ) RT Relación de Svedberg Determinación de peso molecular M, en forma absoluta (sin estándares de peso molecular) pero hay que conocer S o D. 1 Svedberg, 1 S = 10-13 s

Experimento de velocidad de sedimentación Experimento de velocidad de sedimentación. Solución de una proteína a determinada concentración, c, la sometemos a centrifugación. Se empieza a mover hacia el fondo del tubo y se genera una zona clara, sólo solvente cerca del menisco y un frente móvil que limita solvente de solución Si seguimos la velocidad con que se mueve ese frente móvil (en una ultracentrífuga analítica), podemos determinar S, coeficiente de sedimentación para esa proteína

Determinación de S v = dr/dt = ω2 r S Integrando: ln r/ro = ω2 S (t – to) El frente de sedimentación es bien definido al principio pero se va deformando a medida avanza, por la difusión de las partículas en el frente. Partículas de alto M, difunden poco y el frente es más definido.

Factores que afectan S Temperatura (S20,w) Masa Forma a mayor M ═> mayor S, para ADN: M½ para proteínas: M2/3 Forma S es inversamente proporcional a f Para partícula esférica no hidratada: fo = 6 π η ro Grado de solvatación Concentración Con la concentración f aumenta ═> S disminuye con la conc. S = So (dil)/ 1 + k conc. Carga

Se agrega a altas conc. Proteína compacta Molécula extendida S varía con el coeficiente de fricción, que a su vez depende de la concentración de la macromolécula utilizada, más fuertemente para moléculas extendidas

Relación entre coeficiente de sedimentación S y tamaño, forma, hidratación S = M (1 - ν ρ) N f f = coeficiente de fricción, depende de tamaño, forma, hidratación de la macromolécula

Relación entre coeficiente de sedimentación S y tamaño, forma, hidratación S = M (1 - ν ρ) N f f = coeficiente de fricción, depende de tamaño, forma, hidratación de la macromolécula Para macromolécula esférica y no hidratada: f = 6 π η ro η = viscosidad del medio ro = radio de la partícula, que está relacionado con su pero molecular, M: Vo = 4/3 π ro3 = M ν /N ν = volumen específico parcial ≈ 1/ρ (partícula) ≈ Vo / m ≈ Vo N/ M S = M2/3 (1 - ν ρ) x 0.012 ν1/3

S = M2/3 (1 - ν ρ) x 0.012 ν1/3

A partir de la determinación de S, puedo inferir algo sobre la forma o el grado de hidratación de mi macromolécula en estudio So = M2/3 (1 - ν ρ) x 0.012 ν1/3 Primero, si conozco el M y asumo forma esférica, puedo calcular So Por otro lado determino experimentalmente S, S20,w Si S20,w > So ═> oligómero Si S20, w < So ═> monómero con forma extendida

A partir de la determinación de S, puedo inferir algo sobre la forma o el grado de hidratación de mi macromolécula en estudio So = M2/3 (1 - ν ρ) x 0.012 ν1/3 Ejemplo: Proteína de 50 kDa, ν = 0.73 mg/ml ═> So = 4.93 Por otro lado determino experimentalmente S, S = 5.67 S (PBS, 30ºC) ═> S20,w = 5.87 S S20,w = 5.87 > So = 4.93 oligómero? Calculo So para el dímero So = 7.75 Para el dímero: S20,w = 5.87 < So = 7.75 El resultado sugiere se trata de un dímero con forma extendida, f/fo >1

S Valores de S de varias biomoléculas, organelos subcelulares y organismos

CENTRIFUGACIÓN Diferencial (sobrenadante + sedimento “pellet”) La idea es sedimentar al fondo del tubo, el componente de mayor S Se usa para separar una mezcla compleja en los distintos componentes en base a sus diferencias de tamaño y/o masa Diferencias grandes de S para lograr separación En general se realiza en sistema homogéneo, pero se puede hacer a través de gradiente de densidad Frente móvil (frente de sedimentación) Las partículas se mueven a una velocidad determinada por su S, pero se detiene la centrifugación antes de que el componente más pesado alcance el fondo del tubo Para separar partículas que difieren en tamaño pero no en densidad (ej. proteínas) Puede ser en sistema homogéneo o en gradiente de densidad

ULTRACENTRIFUGACIÓN EN SOLVENTE HOMOGÉNEO (SIN GRADIENTE) 1) VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN (FRENTE DE SEDIMENTACIÓN) Las partículas se mueven a una velocidad determinada por su S, se separan por diferencia en su tamaño Se forma un frente de sedimentación Se usan velocidades altas (> 100.000 g) Se registra variación de concentración a lo largo del tubo (dC vs dr) 2) EQUILIBRIO DE SEDIMENTACIÓN Las partículas se separan por diferencia en su densidad Se deja alcanzar el equilibrio entre sedimentación y difusión Se forma un gradiente de concentración a lo largo del Se usan velocidades bajas (100 – 10.000 g) Se registra variación de concentración a lo largo del tubo (dC vs dr) y se linealiza: lnC vs r2

EQUILIBRIO DE SEDIMENTACIÓN

EQUILIBRIO DE SEDIMENTACIÓN

Desventajas de los experimentos velocidad de sedimentación: Instrumento caro y especializado: ultracentrífuga analítica Registro de la concentración, necesita compuesto que absorba y concentrado Dificultad en resolver mezclas Analítica, no preparativa ULTRACENTRIFUGACIÓN ZONAL (SOBRE GRADIENTE DE DENSIDAD) La solución de la macromolécula se coloca sobre el gradiente Se usa alta velocidad Se forman bandas (zonas) y no un frente de sedimentación Mejor separación (y recuperación) de los componentes Se puede hacer preparativa

Partícula Densidad (ρ) Gradiente 2 1.7 1.55 1.3 1 – 1.3 1 RNA DNA g/ml RNA 2 Cs2SO4 DNA 1.7 CsCl Ribosomas 1.55 Proteínas 1.3 Glicerol, sacarosa, Ficoll Organelos 1 – 1.3 Sacarosa, Ficoll, Percol Lipoproteínas 1 KBr

EQUILIBRIO DE SEDIMENTACIÓN en gradiente CENTRIFUGACIÓN ISOPÍCNICA En ro: ρ(gradiente) = ρ(particula) = 1/ ν