Equipo Dr Salamone Daniel Dr Gibbons Alejandro Dra Cueto Marcela Dr Rafael Fernández y Martín Dr Pereyra Bonnet Federico Laboratorio de Biotecnología Animal-Facultad de Agronomía Universidad de Buenos Aires, Argentina Laboratorio de Rumiantes Menores-UE Bariloche Instituto Nacional de tecnología Agropecuaria ANIMALES TRANSGENICOS

Como fabricar una proteína humana? Por ejemplo: la insulina se usa para tratar la diabetes. Como podemos producir toda la insulina que se necesita para tratar a 400 millones de pacientes en el mundo?

Con una BACTERIA

PRODUCCIÓN DE UNA PROTEÍNA

Plásmido (vector de ADN) Plásmido pCX-EGFP Animales Transgénicos

Otros sistemas Plantas transgénicas Animales transgénicos Animales Transgénicos

ADN humano Gen de la Insulina “Vacas que expresan insulina en la leche” (25 vacas para demanda mundial) Ovulo de vaca Introducción

Como? Promotor de las glándulas mamarias Gen de la Insulina Direccionamos la expresión!!! Animales Transgénicos

Recolección de los ovocitos Obtención de ovocitos a partir de animales sacrificados para consumo - Progreso genético mínimo - Garantía sanitaria escasa - Uso en Investigación Aspiración de los folículos antrales Complejos cúmulus-ovocitoLavado de ovarios

Cultivo in vitro = Animales Transgénicos

Microagujas Equipo de laboratorio Animales Transgénicos

Transgénicos por microinyección de pronúcleos Gordon et al., 1980 (PNAS)

Transgénesis por microinyección de pronúcleos Laboratorio de Biotecnología Animal, FA-UBA Gordon y col., 1980 (PNAS) (-) -Mosaicismo -Baja eficiencia (0,003 % Bovino) -Inserción del transgén al azar (+) -Ampliamente usada

Introducción Wilmut et al., 1997 Nature 385,810–813. Clonación oveja Dolly

75 Day Fetus Tissue culture Fetal cells FIBROBLAST oocyte EXTRACCION DE NUCLEO Enucleated oocyte FUSIÓN CELULAR OVULO ACTIVADO CON NUCLEO DE FIBROBLASTO 7 Days embryo Recipient cow Embryo transfer 278 days Cloned calf

PASOS DE LA CLONACIÓN ENUCLEACIÓN Fotos Cyagra

PASOS DE LA CLONACIÓN TRANSFERENCIA NUCLEAR Fotos Cyagra

Transgénesis por clonación (SCNT ) Laboratorio de Biotecnología Animal, FA-UBA Cibelli y col., 1998 (Science) (+) -Ampliamente usada -Identificar integración del transgén in vitro (-) -Impronta -Eficiencia 1-3% -Inserción del transgén al azar -Consumo de tiempo

TRANSGENESIS MEDIADA POR ESPERMATOZOIDES Además del ADN paterno (función natural), el espermatozoide lleva ADN exógeno

Ovocito Gen exógeno Espermatozoide espermatozoide llevando el gen exógeno al interior del ovocito ESQUEMA DE LA TECNICA Animales Transgénicos

Laboratorio de Biotecnología Animal, FA-UBA Coincubación Plásmidos Espermatozoides Incubación espermatozoides/plásmidos

ICSI Pipeta de holding 1er. CP Espermatozoide Transgénesis por Espermatozoides

ICSI Lugar de deposición Transgénesis por Espermatozoides

ICSI Sin espermatozoide Transgénesis por Espermatozoides

Transgénesis mediada por espermatozoides Laboratorio de Biotecnología Animal, FA-UBA (+) -Sencilla -Alta eficiencia (-) -No ha sido usada en rumiantes -Inserción del transgén al azar -Mosaicismo en embriones Brinster y col., 1981 (PNAS)

Microscopía confocal Plásmido marcado color verde (FITC) Núcleo espermático color rojo (IP) Laboratorio de Biotecnología Animal, FA-UBA (1000x)

Microscopía confocal de ovocito inyectado Espermatozoide con ADN exógeno Núcleo ovocito Ovocito Laboratorio de Biotecnología Animal, FA-UBA (400x) qPCR Copias del plásmido 3x10 5 moléculas por espermatozoide.

91% GFP tratamiento corto y 66% GFP tratamiento largo.

Caballos 29% Gatos 26% (Med Vet J. Jarazo) Vacas 23% Laboratorio de Biotecnología Animal, FA-UBA Cerdos 60% (R. Olivera) Mosaicismo20-60%

Modificación Modificación genética a realizar Cutícula (cutina) Hongo fitopatógeno Fusarium solani CUTINASA Sintetizar el gen de la cutinasa con un promotor de glándulas salivales Transferirlo a una Oveja para que exprese cutinasa en saliva y aproveche mejor la oferta forrajera

Laboratorio de Biotecnología Animal, FA-UBA Esperanza 1 (25/04/08) Esperanza 2 (04/08/09) Dinastía ESPERANZA Negativos para el transgén por PCR y Southern blot. Confirmación de paternidad por microsatélites.

Laboratorio de Biotecnología Animal, FA-UBA

Papers y Reconocimientos Laboratorio de Biotecnología Animal, FA-UBA 2009 Medalla de Oro OMPI SBTE 2007 INNOVAR 2008

Leche humanizada de vaca INTA Balcarce y Univ. de San Martín RositaIsa Laboratorio de Biotecnología Animal, FA-UBA Ganadería Bovinos resistentes a la “vaca loca” Richt y col., 2006.

Transgénicos por Clonación

Medicamento producido por animales transgénicos autorizado por la FDA. Laboratorio de Biotecnología Animal, FA-UBA GTC Biotherapeutics, Massachusetts.

Ratones: Modelos de Enfermedades o para Investigaciones Laboratorio de Biotecnología Animal, FA-UBA

Producción de órganos para xenotransplante: - Producción cerdos que expresan proteínas humanas que bloquean la acción del complemento (ej. CD59). - Transplantes de corazón o hígado en forma temporaria hasta la obtención de donante compatible.

1796 Edward Jenner, descubre de la “vacuna” antivariólica. Viruela: Causante en el Siglo XVIII de 60 millones de muertes Siglo XX: En Mayo de 1980, la OMS declara oficialmente la erradicación mundial de la viruela humana Pasado Las Vacunas: Primer ejemplo de la utilidad de los animales de granja en la salud humana. Animales Transgénicos

Presente Fermentador como bioreactor para producir vacunas y proteínas recombinantes para la salud humana Animales Transgénicos

En el siglo XVIII y en oposición a la tecnología de Jenner, se dijo: “Existen informes fidedignos de niños que habían empezado a mugir y andar en cuatro patas y de gente con cuernos” por haber sido vacunados. La realidad demostró lo contrario, ¿hoy en el Siglo XXI, escuchamos comentarios similares? Siempre se escuchan las voces de los detractores del desarrollo científico Animales Transgénicos Futuro