INDUCCIÓN DE PROTEÍNA RECOMBINANTE EQUIPO 4

Recombinación Genética Es un proceso que lleva a la obtención de un nuevo genotipo a través del intercambio de material genético entre secuencias homologas de ADN de dos orígenes diferentes. Las secuencias homologas de ADN tienen la misma secuencia o casi la misma. Para que aparezcan nuevos genotipos como consecuencia de la recombinación es esencial que las dos secuencias homologas sean genéticamente diferentes.

En células procariotas solo existe un cromosoma por lo que antes de la recombinación, un cromosoma homologo debe de ser transferido de una bacteria donadora a una receptora. La recombinación ocurre después de la transferencia y ocurre en cualquiera de los siguientes tres procesos: Transformación Transducción Conjugación

ADN Recombinante Las moléculas de ADN producidas mediante la unión de dos o mas fragmentos de ADN se denominan Moléculas de ADN Recombinante. El desarrollo de la tecnología de DNA Recombinante permite la producción de proteínas nativas o modificadas con nuevas y mejores propiedades

Proteína Recombinante Es aquella proteína cuya síntesis se realiza en un organismo distinto al organismo nativo, se logra mediante la inserción del gen que expresa la proteína de interés en un organismo diferente. Es posible obtener altas cantidades de proteína con bajos costos de producción y altas purezas de una o varias proteínas de interés.

Sistemas de expresión Organismo hospedero. Vector de expresión o fragmentos de DNA que poseen elementos génicos necesarios para realizar los procesos de transcripción y traducción en el hospedero, recibe las moléculas de DNA recombinante.

Los sistemas bacterianos, los más utilizados para producir PROTEÍNAS RECOMBINANTES VENTAJAS + Fácilmente manipulables genéticamente. + Se propagan rápidamente. + Económicos. + Requieren entrenamiento mínimo. + Permiten su automatización

DESVENTAJAS Las proteínas de eucariontes o de membrana generalmente no se expresan o no son funcionales. El carácter químico del citoplasma de las bacterias, de sus chaperonas y las enzimas encargadas de las modificaciones post-traduccionales son muy diferentes entre los organismos eucariontes. Pueden agregarse en el citoplasma en llamados CUERPOS DE INCLUSIÓN

Vectores de expresión como el pET son usados comúnmente para la expresión de proteínas heterólogas en E. coli. Los plásmidos son clonados bajo las señales de expresión fuerte del promotor del bacteriófago T7 (controla la alta expresión de la RNA polimerasa T7). Los sistemas pET cuentan además con una copia del gen cromosomal de la RNA polimerasa T7 bajo el control del operador de la lactosa (Para que se exprese la RNA polimerasa T7 se debe introducir lactosa o un análogo de ésta: isopropil β-D tiogalactosido (IPTG)).

Mecanismo de acción del IPTG en la expresión de proteína mediada por el vector pET IPTG se une a la proteína represora Le impide unirse al DNA, ya que al unirse, impide la transcripción del gen para la RNA polimerasa T7 y la transcripción del transgene. IPTG es llamado inductor ya que el efecto de liberar la represión del gen se denomina inducción. El gen de la proteína represora, se codifica en el vector Lac

“A pocas horas de inducción, la formación de la proteína deseada puede llegar a ser más del 50% de la proteína total en la célula”

Producción de proteína recombinante en organismo no relacionado Proteína no funcional La proteína no presenta las modificaciones post- traduccionales necesarias La proteína no se plegó adecuadamente (aglomeración, CUERPOS DE INCLUSIÓN) Formación de cuerpos cetónicos (solo solubilizables en detegentes) Aumento en costos de producción o recuperación de proteína

APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS ¿Para qué? Para el aislamiento de un gen de un organismo para introducirlo en otro ¿Cómo?

¿Para qué tipo de proteínas? Se puede producir de todo tipo de proteínas Proteína Tipo de vector Gen de interés Selección Obtención y clonación de

OBJETIVO Realizar el monitoreo de la inducción de la PROTEÍNA RECOMBINANTE (OMP-beta-lactamasa) en células de E. coli BL21 (células especializadas en producir proteína) transformadas con el vector pET-TEM-1-ompA beta-lactamasa .

MATERIALES Medio LB Kanamicina (El vector contenía un gen de resistencia a kanamicina) IPTG (inductor) CULTIVO DE CÉLULAS TRANSFORMANTES (crecimiento de toda la noche) 8 mL LB

METODOLOGÍA Leer la absorbancia al inicio y cada media hora contra un blanco de medio luria

Cultivo entre 0.6 y 0.8 Abs METODOLOGÍA

MATERIALES Y REACTIVOS GELES DE POLIACRILAMIDA SDS 1 POR EQUIPO AMORTIGUADOR DE CORRIDA AMORTIGUADOR DE MUESTRA SOLUCIÓN TEÑIDORA SOLUCIÓN DESTEÑIDORA ESTÁNDAR DE PESO MOLECULAR

CORRIMIENTO ELECTROFORÉTICO DE LAS MUESTRAS DE PROTEÍNA

METODOLOGÍA

Curva temporal de inducción de proteína recombinante