Espectroscopía de Fluorescencia Ana Denicola

DIAGRAMA DE JABLONSKI (1898-1980) hA conversión interna IC relajación vibracional T1 cruce intersistemas ISC kNR ISC hP fosforescencia kNR IC hF fluorescencia

LUMINISCENCIA emisión de luz desde un estado electrónicamente excitado Se alcanza el estado excitado por absorción de luz en: FLUORESCENCIA estado singulete excitado, transición permitida, ns FOSFORESCENCIA estado triplete excitado, transición prohibida, ms QUIMIOLUMINISCENCIA se alcanza el estado excitado por una reacción química

10-8 s 10-15 s 10-3 s

LA CLAVE ES LA ESCALA DE TIEMPO DE LOS PROCESOS: • ABSORCION: ~ 10-15 seg • CONVERSION INTERNA: ~ 10-11-10-9 seg • FLUORESCENCIA: ~ 10-10 a 10-7 seg • FOSFORESCENCIA: ~ 10-6 a 1 seg (es una transición “prohibida” por simetría) • RELAJACION VIBRACIONAL: ~ 10-12-10-10 seg Los pasos propiamente dichos de absorción y de emisión son extremadamente rápidos, tanto que los núcleos no llegan a moverse (principio de Franck-Condon). La absorción sólo da información del entorno inmediato a la molécula que absorbe. La relajación vibracional por lo general es mucho más rápida que la fluorescencia, entonces la molécula se relaja completamente y (en general) sólo vemos la emisión desde el estado S1. La escala de tiempo de fluorescencia es la misma que la escala de tiempo de movimientos moleculares, por eso el espectro de fluorescencia posee información de un entorno más amplio que el de absorción.

FLUORESCENCIA 1er. paso: absorción o excitación energía suficiente para llegar a nivel electrónico superior S1 o S2 λexc 2do. paso: emisión de luz energía radiativa emitida menor que la absorbida, λem > λexc Corrimiento de Stokes ESTADO EXCITADO

RENDIMIENTO CUANTICO DE FLUORESCENCIA: Q = # fotones emitidos / # fotones absorbidos 0 < Q < 1 en términos de las constantes cinéticas de cada proceso: Q = kF / (kF +  kNR) donde kNR son todos los procesos de decaimiento no radiativos TIEMPO DE VIDA: tiempo promedio que un fluoróforo pasa en el estado excitado antes de volver al estado basal (por cualquier vía)  = 1 / (kF +  kNR) TIEMPO DE VIDA NATURAL: es el tiempo de vida si sólo volviera por fluorescencia n = 1 / kF se puede calcular a partir de  y Q: n =  / Q

Rendimiento (Q) = fotones emitidos <1 fotones absorbidos = constante de velocidad de emisión = constante de velocidad de decaimiento no radiativo

= tiempo de vida intrínseca o natural, sin ningún proceso no radiativo = tiempo de vida medida

Parámetros a medir en fluorescencia Intensidad de fluorescencia (ISS) Espectros de excitación y emisión (IF vs λ) λmax(ex), λmax(em) Rendimiento cuántico de fluorescencia (Q) Vida media del fluoróforo () Anisotropía (r) (tiempo de correlación rotacional) Eficiencia RET (E) (distancia de Föster)

Intensidad de fluorescencia (estado estacionario) ISS Intensidad resuelta en el tiempo () Pulso de luz Iluminación continua

ESPECTROFLUORÍMETRO

La medida de IF es relativa a la geometría del equipo ESPECTROFLUORÍMETRO FUENTE DE LUZ Xe, Hg-Xe, Hg (high- low-P), Diodo (lase, LED) MONOCROMADORES excitación y emisión vs FILTROS ancho de banda polarizadores DETECTOR tubo fotomultiplicador (PMT) MUESTRA geometría de iluminación de la muestra La medida de IF es relativa a la geometría del equipo

Usar soluciones diluidas A < 0..05 Control con solo solvente Usar adecuada λexc, filtro, conc. fluoróforo Filtrar la solución

Intensidad de Fluorescencia y concentración del fluoróforo Efecto de filtro interno

Cuantificación del fluoróforo midiendo Intensidad de fluorescencia IF IF (λex, λem) = IA Φ Z Z = factor instrumental Φ= rendimiento cuántico de F IA = IT - I0 = I0 (1 – exp(-2.3 ε c l) ε = coef. Absortividad a λexc c = concentración del fluoróforo Si Aλ << 1  IA = I0 (2.3 ε c l) IF (λex, λem) = I0 Φ Z 2.3 ε c l IF es proporcional a la conc. Si trabajamos con conc. diluidas

Fluoróforos en bioquímica Fluorescencia intrínseca fluorescencia natural, propia del sistema Fluorescencia extrínseca agrego a la muestra un fluoróforo externo (sonda fluorescente)

Fluorescencia en: Proteínas, fluorescencia intrínseca debido a residuos aminoacídicos aromáticos, predomina el triptofano. Además marcado con sondas fluorescentes (FITC, DNS). GFP y derivados. Ácidos nucleicos, sin fluorescencia intrínseca, se agregan sondas fluorescentes catiónicas planares (EtBr, DAPI) o fosfolípidos marcados Membranas, no fluorescentes, se agregan sondas liposolubles con baja fluorescencia en agua (DPH, ANS)

Fluorescencia en: NAD(P)H FAD, FMN Piridoxal fosfato (PLP) Clorofilas Indicadores fluorescentes (pH, Na+, Cl-, Ca2+, O2)

4.7 ns en solución (2.3 ns FMN) 0.3-1 ns unido a prot. 0.4 ns en solución 1-5 ns unido a DH

Phe Abundancia: 3.5% Tyr Abundancia: 3.5% Trp Abundancia: 1.1% ex = 260 nm, em= 282 nm (Q. ~ 5) Insensible al entorno Tyr Abundancia: 3.5% ex = 275 nm, em= 303 nm (Q. ~ 220) Insensible al entorno, quencheable Ionizable, tirosinato emite (<Q) Trp Abundancia: 1.1% ex = 295 nm, em= 350 nm (Q. ~ 770) Sensible al entorno, quencheable Varias 

Sondas fluorescentes para proteínas Fluoresceína (y Rodaminas) absorbe y emite en el visible, alto rendimiento, ε=80.000 M-1cm-1 DNS-Cl sensible a polaridad del entorno, fluorescencia polarizada

Compuestos de B (BODIPY) absorben y emiten en el visible, alto rendimiento, ε=80.000 M-1cm-1, fotoestables, insensible al solvente y pH

Sondas fluorescentes para ácidos nucleicos Bases modificadas fluorescentes

GFP = Green Fluorrescent Protein Formación espontánea del fluoróforo al plegarse

X X* hν hν’  (ns) Relajación por solvente Transferencia de energía Quenching Transferencia de carga Disociación de H+ Formación de complejos Formación de oligómeros X X* hν hν’  (ns)

Efectos del solvente y del entorno local sobre la fluorescencia H = hexano CH = ciclohexano T = tolueno EA = acetato de etilo Bu = butanol

Efectos del solvente y del entorno k >> 1/ k  1/ Corrimientos de Stokes dinámicos

Ecuación de Lippert-Mataga El fluoroforo es consideredo un dipolo en un medio continuo de constante dieléctrica (permitividad) uniforme Materiales dieléctricos, conductores y medios biológicos In the description of general solvent effects the fluorophore is considered to be a dipole in a continuous medium of uniform dielectric constant (Figure 6.5). This model does not contain any chemical interactions, and hence cannot be used to explain the other interactions which affect the emission. These other interactions, such as hydrogen bonding or formation of charge transfer states, are sometimes detected as deviations from the general theory. Solvatación de iones Saturación dieléctrica en las cercanías del ión 34

Cambio en la emisión por cambio de solvente o cambio del entorno (ej Cambio en la emisión por cambio de solvente o cambio del entorno (ej. unión a proteína) HSA = albúmina humana ANS = Anilinonaftalensulfonato (fluoróforo muy sensible a la polaridad entorno)

Cambio en la emisión por cambio de solvente o cambio del entorno (ej Cambio en la emisión por cambio de solvente o cambio del entorno (ej. unión a proteína)

Determinar constantes de unión de un ligando si este es fluorescente y su fluorescencia cambia con la unión o si la fluorescencia intrínseca cambia por efecto de la unión de un ligando

Emisión del triptofano es sensible al entorno (ej Emisión del triptofano es sensible al entorno (ej. desnaturalización de proteína) N = nativa U = desplegada “unfolded”

Usos de fluorescencia en bioquímica Localización subcelular Cambios en la concentración Interacciones moleculares Cambios conformacionales Distancias intra/intermoleculares Difusión rotacional Caracterización estructural Actividad enzimática ●●●