BASES TEORICAS USO DE PAM

Presentación del tema: "BASES TEORICAS USO DE PAM"— Transcripción de la presentación:

1 BASES TEORICAS USO DE PAM
FLUORESCENCIA BASES TEORICAS USO DE PAM

2 FLUJO DE ENERGÍA Calor (17 – 18%) Luz Fotosíntesis (100%) (~ 80%)
Estos 3 procesos compiten entre si, por lo que el aumento de uno se reflejara en la disminución del rendimiento del otro. Por tanto, si medimos el rendimiento de la fluorescencia se puede obtener información sobre los otros dos procesos. La medicion de la fluorescencia es muy facil, aunque sea apenas el 1 a 2% de la luz absorvida, esto porque el espectro de la fluorecnecia es diferente del de la luz absorvida. El pico de emision de la fluorecencia es de una longitud de onda un poco mayor (685 nm), contra los 675 de la Chla. Fluorescencia (1 – 2%)

3 Back 1 A temperatura ambiente aprox. El 90% de la fluorescencia se origina en el fotosistema II Back 2

4 e- Fo Fm QA QA- hv C.R. Abierto C.R. Cerrado En P680 P680
En que consiste el proceso? Cuando un alga esta en obscuridad todos sus centros de reacción están abiertos. Esto quiere decir que estan oxidados y prontos a utilizar la energia luminosa en los procesos fotoquimicos. Cuando reciben la energia luminosa la cla se reduce, y libera un electron que pasa al aceptor primaria Qa el cual también se reduce. En este proceso parte de la energia es perdida como fluorescencia como parte de la eficiencia del sistema. P680 P680 C.R. Abierto C.R. Cerrado

5 Porque medir la fluorescencia?
Luz emitida como fluor. Rendimiento cuántico de la fluorescencia = Luz absorbida Como forma de inferir sobre los otros procesos relacionados a la fotosíntesis Como medir el rendimiento cuántico de la fluorescencia? Sistemas de medición modulada … o sea … fuente luminosa es activada y desactivada a una alta frecuencia y un detector mide la luz emitida como fluorescencia (685 nm) Phyto - PAM

6 (FF o FPSII) Fefectivo Fmaximo Rendimiento Quántico
Luz emitida como fluorescencia Rendimiento Quántico de la Fluorescencia (FF o FPSII) = Luz absorbida Fo Fm Luz de medida Pulso de saturacion Luz Actinica Apaga Luz Alga adaptada a oscuridad a luz Fv Ft Fm’ Fo’ Amortiguamiento no fotoquímico (qN) Fotoquímico (qP) F’v Fmaximo Fefectivo El rendimiento nos da una medida de lo cuanto es perdido como fluorescencia con respecto a lo absorbido = eficiencia del sistema. Cuanto mayor sea el rendimiento mas emisión por fluorescencia indicando que la luz no esta siendo utilizada en los procesos fotoquimicos de la fotosintesis. O sea, hay una relación inversa entre el rendimiento quántico de la fluorescencia y el rendimiento quántico de la fotosíntesis. Luz de medida es lo suficientemente baja como para detectar Fo pero manteniendo todos los centros de reacción abiertos (oxidados) Fv indica el potencial de transporte de electrones del PSII denominado de rendimiento quantico optimo El pulso de saturacion reduce la quinona A (QA) y se alcanza Fm. La Fv’ es menor que Fv porque existe una cierta cantidad de energia que esta siendo disipada a traves de mecanismos de amortiguamiento no fotoquimico (calor). Donde qN son todos aquellos procesos que provocan una disminución en el rendimiento de la fluorescencia independiente del estado de oxidacion del aceptor QA. qP por otro lado es aquel amortiguamiento que dependen totalmente del estado de oxidación de QA, o sea, del proceso fotoquímico de transferencia de electrones. Ft es la fluorescencia transitoria la cual depende de la irradiancia a que estuvo aclimatada esta alga y es mas elevada que Fo porque aquí algunos centros de reaccion estan cerrados y algunos abiertos mientras que cuando medimos Fo TODOS los centros de reaccion estan abiertos.

7 Proporción de CR abiertos
De la luz absorbida, cual proporción es usada en la fotoquímica: INDICADOR DE EFICIENCIA DEL PSII foptimo fefectivo Proporción de CR abiertos Amortiguamiento Fotoquímico Amortiguamiento No-Fotoquímico

8 Que hace variar a qP? Que hace variar a Fv/Fm?
CR que se cierran, debido a saturación de los CR Que hace variar a Fv/Fm? Cambios en la eficiencia de qN Valores están alrededor de 0.7 (P/fitoplancton) Valores inferiores se relacionan a stress (fotoinibicion !!!)

9 NPQ ≈ qn El principal: qE
Sus cambios están relacionados a cambios en la eficiencia de disipación de calor en comparación a la muestra aclimatada a oscuridad Su incremento se relaciona a procesos de protección al exceso de luz Se puede evaluar a través del tiempo que cada proceso toma para regresar a su estado “de oscuridad” o “estacionario” (relaxation time) después de un tiempo de iluminación: minutos a horas … Se divide en qE, qT y qI. El principal: qE qE: high energy state quenching pH bajo en el lumen y formación de zeaxanthina Que pasa? Si alga vuelve a estar en oscuridad qE va a disminuir en cuestión de minutos TODOS LOS PROFESOS QUE SE RELAJAN EN POCOS MINUTOS DESPUES DE ENTRAR EN OSCURIDAD REFLEJAN MECANISMOS DE FOTOPROTECCION

10 LA Serodio et al., 2005 LB Dark Fo Fm Fv Ft Fm’ Fo’ (qN) (qP) F’v

11 ETR = Tasa de Transferencia de Electrones (TTE) - mmol electrones. m-2
ETR = Tasa de Transferencia de Electrones (TTE) - mmol electrones. m-2. s-1 k = cte. que depende de la especie o grupo e indica la fracción de la luz absorbida que es direccionada para PSII (en comparación a PSI). = Luz absorbida (PFDa: Photon Flux Density) ETR: representa el transito (velocidad) de electrones a través de toda la cadena de transporte fotosintético. E = irradiancia 3600 transforma segundos a hora o Diatomeas = 0.80 (80% de la Cla esta asociada a PSII) Clorofitas = 0.50 Dinoflagelados = 0.80

12 Unidades ETR = mmol electrones. m-2. s-1
fPSII = mol separación de cargas. mol quanta-1 = mmol. m-3. h-1 af ( nm) = m-1 E (Irradiancia PAR) = mmol quanta. m-2. s-1

13 fCO2 fO2 mg C. mg Chla. h-1 mg O2. mg Chla. h-1 Irradiancia, E (PAR)
(mg C. mg Chla-1. h-1)(mmol. m-2. s-1)-1 (mg O2. mg Chla-1. h-1)(mmol. m-2. s-1)-1 Irradiancia, E (PAR) El mismo tipo de curva se obtiene al evaluar la productividad primaria con respecto a la irradiancia Aquí los parametros son denominados de diferentes maneras y las unidades van a depender de si estimamos la productividad usando el método de carbono-14 o de oxigeno. Como comparar? Ver que son procesos de diferentes etapas de la fotosíntesis Porque? Es una forma de obtener información sobre el estado fisiológico del fitoplancton de una manera mas rápida y menos dispendiosa Alfa puede ser una medida del rendimiento máximo en cultivos densos donde toda la luz incidente es absorbida. Esto NO es el caso en el ambiente natural …. A no ser quizás en el caso de floraciones. fCO2 fO2 = aB/ af mg C. mg Chla. h-1 mg O2. mg Chla. h-1 (mg C. mg Chla-1. h-1)(mmol. m-2. s-1)-1 (mg O2. mg Chla-1. h-1)(mmol. m-2. s-1)-1

14 ETR ETRmax Irradiancia, E (PAR) aETR = mmol electrones. m-2. s-1(mmol quanta. m-2. s-1)-1 ETRmax ETR

15 Como comparar? Porque comparar? fO2 = 0.25 fPSII
son necesarias 4 separaciones de carga (electrones) para producir 1 molécula de O2: t = 0.25 fO2 = 0.25 fPSII (Máximo valor teórico) PPB (mmol O2. m-2. s-1) = ETR x t PPB (mg O2. m-2. s-1) = ETR x t x 0.032 Esto exige una serie de consideraciones … Con relacion a la relacion P-E (oxigeno) / P-E (ETR) existe una relación directa que ha sido evaluada en muchos trabajos. El hecho de 4/1 de O2 nos da un máximo teórico PPB (mg C. m-2.s-1) = ?

16 En Gilbert et al, 2000

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20 Phyto-PAM Comparación de curvas

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24 Phyto-PAM Luz de medida: para determinar el nivel basal de fluorescencia de alga adaptada a oscuridad Canal 1: 470 nm Canal 2: 520 nm Canal 3: 645 nm Canal 4: 665 nm ~ 0.3 mE.m-2.s-1 Luz Actínica 655 nm – hasta 2000 mE.m-2.s-1

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26 EJEMPLO

27 HPLC

28 Coeficiente de Absorcion normalizado

29 Ch. muelleri y A. carterae - Canal 3 (650 nm)
T. suecica ETRmax = 68.1 a = 0.51 Ek = 133 El Phyto-PAM fue desarrollado inicialmente para diferenciar los principales grupos del fitoplancton presentes en la muestra con base en las diferencias entre los cuatro canales de emision. En el caso de cultivos este aspecto es de menor importancia y mostraremos los resultados derivados del canal que fornece la respuesta de mayor intensidad. Ch. muelleri y A. carterae - Canal 3 (650 nm) T. suecica - Canal 4 (665 nm) ETRmax = 68.6 a = 0.39 Ek = 176 ETRmax = 45.9 a = 0.16 Ek = 287 Diferencia en la capacidad fotosintetica Mayor eficiencia en el uso de la luz para la transf de electrones por la diatomea y menor en Tetrasselmis

30 Ch. muelleri A. carterae T. suecica PBmax = 12.42 aB = 0.099 Ek = 167
Aqui se observa una situacion inversa donde la diatmoea presenta la minima capacidad fotosintetica y al mismo una menor eficiencia en la abosrcion de luz con respecto a la produccion de carbono. PBmax = 3.29 aB = 0.019 Ek = 125

31 Ch. muelleri A. carterae T. suecica PBmax = 772.3 aB = 20.59
Ek = 37.59 PBmax = 122.9 aB = 7.35 Ek = 16.7 Nuevamente la diatomea se muestra con menor capacidad fotosintetica …pero los valores de Amphy y Tetra estan muy fuera de rango … Creemos que esta metodologia debe ser revisada para estudios con cultivos densos de fitoplancton … en principio fue desarrollada para mediciones de productividad de bacterias. PBmax = 21.53 aB = 0.46 Ek = 46.8

32 ETRmax PBmax Relacion Inversa? aPAM aC14 Relacion Inversa