Antonio Martínez, Janeth Luna y Bernardo Clavijo Modelos matemáticos Antonio Martínez, Janeth Luna y Bernardo Clavijo Unidad Asociada de Calidad Seguridad de Alimentos (UPCT-CSIC) y Universidad Tadeo Lozano

COMMISSION REGULATION (EC) No 2073/2005 of 15 November 2005 on microbiological criteria for foodstuffs Article 3 As necessary, the food business operators responsible for the manufacture of the product shall conduct studies in accordance with Annex II in order to investigate compliance with the criteria throughout the shelf-life. In particular, this applies to ready-to-eat foods that are able to support the growth of Listeria monocytogenes and that may pose a Listeria monocytogenes risk for public health.

Annex II When necessary on the basis of the abovementioned studies, the food business operator shall conduct additional studies, which may include: predictive mathematical modelling established for the food in question, using critical growth or survival factors for the micro-organisms of concern in the product,

Generalidades sobre los modelos matemáticos predictivos

Every model is wrong. The question is, how much wrong still useful it can be. (Box and Draper)

MICROBIOLOGÍA PREDICTIVA Campo de estudio que combina elementos de microbiología, matemáticas y estadística para desarrollar modelos que describan y predigan matemáticamente el crecimiento o muerte de los microorganismos, cuando se les somete a condiciones medioambientales específicas (Whiting, 1995).

Los modelos son descripciones simplificadas de la realidad  La realidad descrita por el modelo es una parte de la realidad total llamada espacio modelo

 Los modelos deben reflejar lo que está pasando y deben ser capaces de predecir con precisión los estados presente y futuro de las cosas que describen  Hay que ser conscientes de que un modelo no puede dar una representación total de la realidad. Un modelo particular puede describir algún aspecto de forma muy adecuada mientras que falla en la descripción de otro

Suposiciones en modelización Espacio Modelo: No se puede modelizar todo, hay que escoger la parte de la realidad que se quiere modelizar. A esto se le llama espacio modelo y no tiene conexión con el resto de la realidad realidad espacio modelo

Espacio modelo: Se define como todos los factores que juegan un papel en la determinación del fenómeno bajo estudio, los conocidos y no conocidos

Fenómeno: Los modelos se usan para describir relaciones entre variables dependiente e indepen- dientes. V. dependiente Fenómeno Relación V. Independientes

Para poder modelizar un fenómeno en un espacio modelo determinado es necesario entender la relación entre las variables depen- diente e independientes. Este ejercicio ayudará a elegir el modelo apropiado

Microbiología predictiva El objetivo de la microbiología predictiva es conseguir un Espacio Modelo para describir un Fenómeno de forma matemática o probabilística Espacio modelo Medioambiene Temperatura pH aw Fenómeno Respuesta microbiana Crecimiento Inactivación

La microbiología predictiva no revela, generalmente, comportamientos inesperados de los microorganismos. La Microbiología predictiva cuantifica los efectos de la interacción entre dos o más factores y permite la interpolación de combinaciones de factores no comprobados de forma explícita

Clasificación de los modelos Modelos de nivel primario: Modelo de Bigelow Modelos de nivel secundario: Superficie de respuesta Modelos de nivel terciario: Tejedor y Martínez

Los modelos de nivel primario describen cambios en el número de microorganismos u otras respuestas microbianas con el tiempo. inactivación crecimiento

Los modelos secundarios describen las respuestas de los parámetros de los modelos primarios a los cambios en las condiciones medioambientales superficie de respuesta Ln(spec.g.rate) pH NaCl (%)

Los modelos terciarios son programas de ordenador que transforman a los modelos primarios y secundarios en herramientas de facil uso para los usuarios del modelo Inactivación crecimiento

Consideraciones en el desarrollo de un modelo  Precisión en el ajuste.  Capacidad de predecir combinaciones de factores no probadas.  Incorporación de todos los factores relevantes.  Que tenga el mínimo número de parámetros.  Especificación del término de error.  Los parámetros deben tener un significado biológico y valores realistas.  Reparametrización si se mejoran las propiedades estadísticas.

Termoresistencia y Modelos primarios de inactivación/supervivencia 1 2 3 4 5 6 7 116 118 120 122 124 126 128 Temperatura (ºC) Log N experimental predicho Bacillus stearothermophilus

Obtención de datos experimentales A) Tratamiento térmico isotérmico B) Tratamiento térmico no isotérmico B.1) La temperatura de la muestra varía con el tiempo B.2)La temperatura de la muestra varía con el tiempo y después permanece constante hasta la fase de enfriamiento

Modelos de inactivación: Velocidad alta de muerte de los microorganismos por la acción de un agente activo Modelos de supervivencia: Disminución de la carga microbiana de forma mas lenta y no implica esterilidad comercial Los modelos matemáticos son los mismos en ambos casos

Capilares Data logger Baño calentamiento Baño enfriamiento

Capilares

Detalle termorresistómetro

Modelos primarios A) Modelos logarítmicos La modelización matemática comenzó en 1920 con los cálculos de tiempo de destrucción térmica. Los valores D y Z se usaron con éxito para asegurar que los alimentos enlatados estaban libres de riesgo de alteración por Cl. botulinum Estos modelos establecen la relación existente entre el tiempo y la inactivación de un microorga- nismo a una temperatura dada.

Los datos experimentales para la obtención de los parámetros, D y Z, que definen la inactivación de los microorganismos se pueden analizar de diferentes maneras:  Dos regresiones lineales consecutivas  Una regresión no lineal en un solo paso

Curva de supervivencia Dos regresiones lineales Curva de supervivencia 3 Log. supervivientes 2 DT 1 Tiempo de exposición

LnN=LnNo-kt

lgN=lgNo-(k/2,303)t

Curva de muerte térmica DT2 Log DT DT1 z T1 T2 Temperatura

Tratamiento isotérmico Una regresión no lineal Tratamiento isotérmico 1 log N = log No - × t æ T - T ö R ç ÷ × è ø D 10 z R

Parámetros cinéticos predichos para dos cepas de Bacillus cereus Tabla 1. Parámetros cinéticos predichos para dos cepas de Bacillus cereus Temperature D value (min) (ºC) AV TZ415 AV Z421 Linear Non-linear 85 90 95 100 105 16 ± 5 a 3.9 0.7 0.94 0.17 0.22 0.06 ND 17.1 0.5 4.04 0.08 0.95 0.02 0.225 0.007 40 20 11 3 2.5 0.4 0.60 0.19 39 9.8 2.48 0.63 0.03 z (ºC) 8.1 0.3 7.97 0.10 8.0 0.6 8.4 0.2 not determined. D value confidence interval (95%).

Curvas de equivalencia Log (No/N) predicted Log (No/N) observed 0.5 1 1.5 2 2.5 3 Log (No/N) predicted Log (No/N) observed 0.5 1 1.5 2 2.5 3 4

Residuos normales con media cero Frequency (Log Nexp - Log Ncal) 5 10 15 20 25 -0.3 -0.2 -0.1 0.1 0.2 0.3 (Log Nexp - Log Ncal) Frequency Residuos normales con media cero 5 10 15 20 25 30 35 -0.7 -0.46 -0.22 0.02 0.26 0.5 (Log Nexp - Log Ncal) Frequency

Regiones de confianza conjunta D (min) z (ºC) 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 7.5 7.9 8.3 8.7 9.1 95ºC AV Z421 90ºC AV TZ415

Efecto del pH sobre el valor D del B. stearothermophilus en ensaladilla 14 14 118 ºC 115 ºC 12 12 Z (ºC) Z (ºC) 10 10 8 8 6 6 1 2 3 4 5 2 4 6 8 10 12 D (min) D (min)

Efecto del pH sobre el valor D del B. stearothermophilus en ensaladilla 14 14 121 ºC 125 ºC 12 12 Z (ºC) 10 Z (ºC) 10 8 8 6 6 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 1 2 D ( min ) D (min)

Diferentes tipos de curvas de supervivencia Hombro 3 Concavidad hacia abajo Lineal Log. supervivientes 2 Concavidad hacia arriba Cola 1 Tiempo de exposición

Los hombros se han atribuido:  a la necesidad de mas de un evento dañino  a la necesidad de una activación de las esporas

Presencia de colas Teoría vitalista Distribución de termorresistencia La termorresistencia depende del ciclo celular en que se recoja Teoría mecanicista

Otras explicaciones Nueva aproximación Presencia de artefactos experimentales Mezcla de poblaciones Otras explicaciones Nueva aproximación La curva de supervivencia es una forma acumulativa de distribución de eventos letales con el tiempo Cada organismo individual o espora de una población muere a un tiempo específico

Curvas con hombros 1 85°C 0.1 90°C 0.01 AVTZ415 strain 95°C 0.001 S(t) (N/No) 100°C 0.0001 0.00001 8 16 24 32 40 Time (min)

Función de supervivencia ÷ ø ö ç è æ = a t - e S(t) a= Scala n= Forma

El parámetro de forma “n” se puede considerar como un índice de comportamiento Si n >1 describe una curva con hombro Si n < 1 describe una curva con cola Si n = 1 la curva de supervivencia sera lineal en coordenadas semilogarítmicas y se comportará como una reacción de primer orden El parámetro de escala “a”se puede considerar como una constante de velocidad de reacción. Similar al Valor D

Curvas de supervivencia 1.00 95°C AVZ421 strain 0.80 97.5°C 0.60 100°C S(t) (N/No) 0.40 102.5°C 0.20 105°C 0.00 0.00 3.20 6.40 9.60 12.80 16.00

( ) = × × f(t) a n t e æ ö - t ç ÷ - n n - 1 è ø Función de densidad frecuencia de muertes por unidad de tiempo

Curva de distribución 0.45 0.36 0.27 AVZ421 strain 0.18 Frecuencia (1/min) 0.09 0.00 0.00 1.80 3.60 5.40 7.20 9.00 Tiempo (min)

Medida de la resistencia térmica ( ) -1 n 1 a tc + G × = G = Función Gama

Comparación entre el número supervivientes experimentales y predichos (min) N N N obs W B 19900000 19900000 24130989 4 13266000 13710010 12433299 8 8360000 7629650 6406158 12 3450000 3759861 3300722 16 1417000 1688864 1700671 A - 1.10 1.20 f

Parámetros para la distribución de Weibull y valor D T Weibull distribution Bigelow model (ºC) scale (a) shape (n) tc (min) D (min) 95.0 8.3 1.36 8.0 14 ± 5 a 97.5 4.5 1.72 4.0 5.9 ± 1.5 100.0 2.10 1.58 1.85 2.5 ± 0.5 102.5 1.35 2.03 1.20 1.5 ± 0.5 105.0 0.65 1.69 0.58 0.76 ± 0.18 z (ºC) (8.9) 8.1

Curva de supervivencia para Bacillus pumillus en condiciones isotérmicas 1 0.1 0.01 Fracción supervivientes 0.001 0.0001 0.00001 0.00 2.40 4.80 7.20 9.60 12.00 Tiempo ( min )

Función de supervivencia é æ t ö ù LnS ( t ) = ç ÷ ê ú a ë è ø û

Curva de supervivencia para Bacillus pumillus mediante Weibull en condiciones isotérmicas 90 º C -3 a =5.47, n =0.32 -6 Ln fraction of survivors -9 -12 -15 0.00 2.20 4.40 6.60 8.80 11.00 Tiempo( min )

Métodos no isotérmicos Ventajas de los métodos no isotérmicos Se obtiene una gran información de cada experimento  Se ahorra tiempo  Se ahorra material y costo en mano de hobra  Son mas cercanos a lo que en realidad pasa en un proceso industrial

Tratamiento no isotérmico Ecuación 1 é ù é No ù ê n 1 ú å Log Log = Log × D t ê ú ê ú ë N û æ T - T ö ç R ÷ ê i = 1 ú D × 10 è z ø ë û R

æ T - T ö 10 ç ÷ - 1 No z æ T - T ö è z ø Log = ´ 10 ç ÷ ´ N D ´ ln 10 Ecuación 2 æ T - T ö 10 ç ÷ - 1 No z æ T - T ö è z ø Log = ´ 10 ç R ÷ ´ N D ´ ln 10 è z ø a R a=Velocidad de calentamiento

Cálculo de las regiones de confianza conjunta

No isotérmico con tramo isotérmico Temperature (°C) Isothermic heating D values (min) Non- isothermic heating D values (min) 118 9.03 10.49 121 3.08 4.38 125 0.93 1.37 z (°C) 7 7.90

Bacillus stearothermophilus 7 6 5 4 experimental Log N 3 predicho 2 1 116 118 120 122 124 126 128 Temperatura (ºC)

Distribución de residuos 10 20 30 40 50 60 70 80 -0.4 -0.2 0.2 0.4 (Log Nexp - Log N cal) Frecuencia

Regiones de confianza conjunta

Bacillus cereus Temperature D (min) (ºC) non-isothermal Isothermal 85 90 95 100 16.0 3.93 0.96 0.236 17.1 4.04 0.95 0.225 z ( ° C) 8.19 7.97 A f b 1.11

Bacillus cereus Equation 1 Equation 2 Activation rate Inactivation rate b Equation 1 Equation 2 (ºC/min) T (ºC) D (min) z (ºC) A f c 0.5 1.0 90 95 3.50 0.42 5.20 0.46 5.4 4.8 1.17 1.13 0.44 5.00 5.6 3.10 0.58 3.90 0.64 6.9 6.3 1.11 1.18 0.62 0.66 7.1 6.5 1.12 Bacillus cereus

Modelos secundarios de inactivación

Tanto los parámetros que definen las curvas de Modelos secundarios Tanto los parámetros que definen las curvas de Inactivación D ó z, como los que definen las curvas De crecimiento m o , se ven afectados por factores Mediombientales pH, ClNa, aw, entre otros.

Los modelos probabilísticos o matemáticos que relacionan las variables dependientes, parámetros cinéticos, con los factores medioambientales son los denominados modelos secundarios

Modelo basado en la ecuación de Arrhenius (Davey, 1993) Modelos secundarios de inactivción Modelo basado en la ecuación de Arrhenius (Davey, 1993) Lnk = c0+(c1/T)+c2pH+c3(pH)2+

Modelo basado en la ecuación de Bigelow (Mafart y Leguérinel, 1998) LogD = LogD*-(1/zT)(T-T*)-(1/zpH)2(pH-pH*)2+

Modelo cuadrático polinomial (Fernández y col., 1996) LogD = c1+c2T+c3pH+c4(TpH)+c5T2+c6(pH)2 +

Modelo básico (Fernández y col., 1996) LogD = c1+c2T+c3pH+

Modelo basado en la distribución de Curvas con colas o con hombros Modelo basado en la distribución de Frecuencia de Weibull (Fernández y col., 2001)

VALIDACIÓN Y EVALUACIÓN DE LOS MODELOS Con nuevos datos obtenidos de forma independiente En condiciones reales de elaboración del alimento A través de ciertos índices (Estadísticamente)

ANÁLISIS DE LOS MODELOS Indices estadísticos Coeficiente de determinación Estudio de los residuos Datos influyentes Multicolinealidad Índices para evaluar modelos en microbiología de alimentos

Coeficiente de determinación Este coeficiente indica la proporción de variabilidad de las observaciones de la variable dependiente (lnK) explicada por el conjunto de las variables independientes consideradas en cada caso.

Estudio de los residuos Los residuos se definen como la diferencia entre el valor observado de la variable dependiente y el valor ajustado en el modelo.

Pruebas habituales para los residuos Descriptivas básicas Test de normalidad (Kolmogorov-Smirnov) Linealidad, homocedasticidad y valores atípicos Autocorrelación entre residuos consecutivos (Durbin-Watson)

Gracias por su atención