Electroforesis de Agarosa José A. Cardé, PhD Lab Biol 3306-Genética Universidad de Puerto Rico-Aguadilla

Objetivos Luego de haber completado el ejercicio, los estudiantes estarán capacitados para: 1. Distinguir entre una electroforesis utilizando geles de poliacrilamida y una electroforesis utilizando geles de agarosa. 2. Explicar los diferentes parámetros que influyen en la separación de los fragmentos de DNA. 3. Preparar un gel de agarosa y separar fragmentos de DNA en el mismo. 4. Estimar el peso molecular de los fragmentos de DNA productos de la digestión con endonucleasas de restricción.

ELECTROFORESIS – CSHL-DNLC Animación ánodo cátodo SOPORTE + - Introducción ELECTROFORESIS: Separación y análisis de macromoléculas (Proteínas, ADN/ARN) en una matriz gelatinosa al aplicarles un campo eléctrico Arne Tiselius 1937 (Nobel 1948) Moléc. +  cátodo (-) Moléc. -  ánodo (+)

Factores que afectan la moVilidad 1 Campo eléctrico Diferencia de potencial (V-voltios): bajo voltaje (10-500 V) Intensidad (A-amperios): flujo de carga eléctrica. - depende de V y de R. - Resistencia: determinada por el soporte. 2 Muestra Carga o densidad de carga: carga eléctrica/masa de la molécula Tamaño: debido al poro de la matriz. Forma: forma globular vs lineal: avanza más.

Factores que afectan la mobilidad 3 Amortiguador - pH: determina el grado de solvatación y la carga de las moléculas generalmente es ligeramente básico  moléculas - - Fuerza iónica: generalmente 0.05 o 0.1 M para que no interfiera 4 Soporte o Matriz - Adsorción - Porosidad molecular - inversamente proporcional a la concentración

Matrices Electroforéticas Características: Gel poroso (tridimensional interno). Tiene que permitir el paso de moléculas. NO puede estar cargado. Matriz del gel Tipos de Soporte (no restrictivo o restrictivo): Electroforesis de proteínas Electroforesis de DNA/RNA no restrictivo (grupo I): papel, almidón, agar, acetato de celulosa. * poro >>> proteínas. * separación sólo por CARGA restrictivo (grupo II): acrilamida * poros = proteínas * separación por CARGA y TAMAÑO restrictivo (grupo II): acrilamida, agarosa * poros = moléculas de DNA/RNA * separación sólo por TAMAÑO

PAGE – Gel de Poliacrilamida: Proteinas 0 ácidos Nucleicos Soporte: (restrictivo) * Geles de Agarosa  moléculas grandes (0.1-60 kpb) * Geles de Poliacrilamida  moléculas pequeñas (6-2000 pb) Electroforesis vertical Ventajas: * Gran poder de resolución por CARGA y por TAMAÑO. * Químicamente inertes. * Transparentes (densitograma). * Estables (pH, fuerza iónica, temperatura). * Versatilidad en cuanto al tamaño de poro.

PAGE – Gel de Poliacrilamida Aplicaciones: Separar proteínas Determinar peso molecular de una proteína Separar proteínas en función de su pI Ver si hay una proteína en concreto SDS-PAGE Electroenfoque Western Blot

Gel de Agarosa – ácidos Nucleicos Soporte: (restrictivo) * Geles de Agarosa  moléculas grandes (0.1-60 kpb) * Geles de Poliacrilamida  moléculas pequeñas (6-2000 pb) Electroforesis horizontal (agarosa) Separación por TAMAÑO Densidad de carga igual para todas las moléculas por los grupos PO4- Buena separación, pobre resolución

Geles de Agarosa Aplicaciones: Separar, identificar y purificar fragmentos de DNA o RNA. Determinar tamaño de un fragmento de DNA. Separación de cromosomas enteros Secuenciación de DNA. Identificación de regiones de unión a proteínas. Detectar la presencia de un gen (o secuencia específica de DNA) en una muestra. Determinar si se expresa un gen específico Geles de agarosa Geles poliacrilamida Southern Blot Northern Blot

Geles de Agarosa Electroforesis horizontal 1. Preparar el gel. muestra (-) + - Campo eléctrico (DV) 1. Preparar el gel. 2. Aplicación de la muestra. 3. Electroforesis. 4. Detección por tinción con Bromuro de Etidio (BrEt): se intercala en el DNA y al irradiarlo con luz UV emite fluorescencia.

Southern Blot * Interacción DNA-DNA (complementación). * Detectar en una mezcla de DNAs una secuencia de DNA específica (muy sensible). * Detectar la presencia de un gen, etc. 1. Electroforesis en geles de agarosa moléculas de DNA e- 4. Revelado DNA interés 32P 2. Transferencia a membrana moléculas de DNA Gel Agarosa Southern BLOT Todas los DNA de interés 5. Resultado 3. Hibridación con la sonda radioactiva DNA interés …ATTGCA… …TAACGT… Sonda de DNA 32P

Northern Blot * Interacción RNA-DNA (hibridación). * Detectar en una mezcla de RNAs una secuencia de RNA específica (muy sensible). * Expresión génica. e- 4. Revelado RNA interés 32P 1. Electroforesis en geles de agarosa moléculas de RNA 2. Transferencia a membrana moléculas de RNA Gel Agarosa Northern BLOT Todas los DNA RNA de interés Resultado 3. Hibridación con la sonda radioactiva RNA interés …AUUGCA… …TAACGT… Sonda de DNA 32P

Determinación de Peso Molecular Marcadores de peso molecular: * Mezcla de diferentes proteínas pre-teñidas de las que conocemos el peso molecular. * Por comparación y extrapolación podemos averiguar el PM de nuestra proteína.

Peso Molecular: Como determinarlo? Es necesario correr, junto a las muestras de interés un marcador molecular estándar. Este posee de 5 a 10 fragmentos de DNA a los cuales se les conoce el peso molecular. Existe una relación lineal entre el logaritmo del peso molecular de las moléculas y la distancia recorrida en el gel. Se crea una curva estándar con distancia de migración en X y el log10 del peso molecular de los fragmentos de DNA en Y Usando esa curva extrapolar el peso molecular de aquellos fragmentos de DNA en estudio.

Para crear la curva estándar es necesario: 1)   Medir la distancia desde el punto de partida (fosas) del marcador hasta cada una de las bandas observadas en el marcador. Estos van en el eje de X. 2)   Determinar el log10 del peso molecular de los fragmentos de DNA que se encuentran en el marcador estándar. Estos van en el eje de Y. 3) Unir los puntos con un “best fit line” 4)   Utilizar la distancia recorrida por las muestras desconocidas y extrapolar a la línea recta, determinar el log 10 del peso y buscar el log inverso para determinar tamaño en bp.

Gel de Agarosa: Peso Molecular

Preparacion de Gel Preparación del gel de agarosa al 1% Pesar 0.5-0.8 g de agarosa y colocarlos en un matraz de 200 Añadir 50-80 ml de amortiguador de la corrida (TBE 1X), se verá turbia. Cubrir el matraz con un pedazo de papel de aluminio (o “saran wrap”) para evitar la evaporación al calentar. Calentar la mezcla hasta que se disuelva la agarosa (hornillas, microondas), se verá transparente. 5. Remover el matraz y dejarlo enfriar hasta ~ 65 ºC. Añadir 2 µl de bromuro de etidio (10 mg/ml).

Preparación de la camara y la Gel 1. Limpiar y secar el molde y la cámara para la gel. Sellar molde para la gel con cinta adhesiva, o según recomienda el fabricante. Asegurarse que este bien bien sellada Verter la agarosa (previamente derretida, ahora tibia) en el molde de electroforesis previamente preparado. Añadir 2 µl de bromuro de etidio (10 mg/ml). Colocar el peine. Esperar 15-20 min a que se solidifique, colocarla en la cámara de amortiguador. Remover el peine y los sellos. Añadir buffer de corrida (TBE/TAE) hasta cubrir los pozos completamente. EtBr para visualizar bandas al final Mutagenico Fluorescente

Preparación de Muestra Preparación de la Muestra Coloque 20 µl de la muestra de DNA cortado con las endonucleasas de restricción en un microtubo de 500 µl. Añada la cantidad predeterminada de de amortiguador de la muestra (“loading buffer”) al mismo tubo. Coloque 10 µl de la muestra del DNA sin cortar con las endonucleasas de restricción en un microtubo de 500 µl. Añada la cantidad predeterminada de amortiguador de la muestra. Coloque 5-7 µl de DNA estándar. Sedimente las mezclas centrifugando por 30 segundos. Coloque los dos tubos en hielo hasta que vaya a colocar las muestras en el gel.

Servir muestras y corrida Usando pipetas de 2-10 o de 10-100 servir las muestras en el orden predeterminado Moléculas estándar en carriles estratégicos Muestras desconocidas en carriles correspondientes Colocar la tapa del tanque de electroforesis y conectarla a la caja de electricidad. Verificar que los polos estén correctamente conectados.  Encender la caja. Correr la electroforesis a 50-80 V por 40- 75 minutos.

Observación de Resultados Apagar la caja de electricidad. Remover la gel cuidadosamente Observarla sobre lámpara luz ultravioleta, fotografiarla. Utilizando una regla, medir las bandas para luego preparar la curva de log10 del peso molecular vs distancia. Descartar buffer y la gel de acuerdo a las medidas correspondientes.

preguntas Que es resolución? Como se mejora en una gel? Como se cambia el tamaño del poro en una gel? Cuales son los componentes del buffer de corrida? Su importancia? Cuales son los componentes del buffer de muestra? Su importancia? Cual es el uso del los marcadores estándar de peso molecular? En que se parecen y en que difieren el Southern Blot del Northern Blot? Que pregunta de investigación contesta cada uno?

Referencias Alberts, et, al., (2014). Essential Cell Biology, 3rd Ed, Garland Science Publishing. New York. Brooker, Robert J. (2014). Genetics Analysis & Principles. (Quinta Edición). New York, McGraw-Hill Companies, Inc. Electrophoresis at DNA Learning Center, Cold Spring Harbor Laboratory (Animation) Agarose Gel Electrophoresis of DNA at Colorado State University Agarose Gel Electrophoresis of Plasmid DNA at Addgene Agarose Gel Electrophoresis (PDF) Agarose Gel Electrophoresis in You Tube by BioRad Laboratories