GENÓMA, GEN Y ADN RECOMBINANTE ralegria@conacyt.gob.sv “INTRODUCCIÓN AL USO DE MARCADORES MOLECULARES PARA CARACTERIZACIÓN DE BIODIVERSIDAD” GENÓMA, GEN Y ADN RECOMBINANTE JOSÉ ROBERTO ALEGRÍA COTO Depto. de Desarrollo Científico y Tecnológico ralegria@conacyt.gob.sv San Andrés, CENTA Auditorio 2 Martes 10 de Diciembre 2002. R. ALEGRÍA CONACYT 2002

CONTENIDO: OBJETIVO INTRODUCCIÓN GENÓMA Y GEN ADN RECOMBINANTE Presentar información básica de manera comprensible sobre la Biología Molecular y sus aplicaciones técnicas. INTRODUCCIÓN GENÓMA Y GEN ADN RECOMBINANTE Técnicas del ADN recombinante Modelos Vegetales Nuevas: proteínas, plantas, animales, alimentos, fármacos Biotecnologías promisorias

AVANCES HISTÓRICOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR 1941 Genes codifican las proteínas 1944 Prueba que el ADN porta la información genética 1953 Determinación de estructura del ADN 1961 Código Genético, ARN mensajero, regulación génica 1967 Wise y Richardson aislaron ADN ligasa 1970 Smith y colegas aislaron y caracterizaron la Hind III 1972 Janet Mertz y Ron Davis cortaron y pegaron mol de ADN 1973 Stanley Cohen y H. Boyer pusieron ADNr en bacterias 1974 Demostración directa de delección génica humana 1975 Southern Blotting 1977 Fred Sanger secuenció el virus de ADN Ф X174 1978 Biblioteca génica humana 1979 RFPL para diagnóstico prenatal, oncogenes celulares R. ALEGRÍA CONACYT 2002

AVANCES HISTÓRICOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR 1979-81 genes humanos clonados y secuenciados 1982 Tabaco, la primera planta modificada genéticamente 1983 Kary Mullis concibe el PCR / Fred Sanger y colegas publican la secuencia del λ lambda 1986 La secuenciación del ADN es automatizada 1987 Inicia el Proyecto del Genoma Humano 1995 Es secuenciado la bacteria Haemophillus influenzae 1996 Es secuenciada la levadura Saccharomyces cerevisiae 1998 Es secuenciado el nemátodo Caenorhabditis elegans 1999 Es secuenciado el cromosoma 22 humano 2000 Es secuenciada la mosca de la fruta D. melanogaster / 26 de junio se presenta 90% borrador genoma humano 2000 14 de dic. secuencia de Arabidopsis thaliana 2001 26 de enero borrador genóma del arroz Oriza sativa R. ALEGRÍA CONACYT 2002

Anticuerpos Monoclonales . Marcadores Ingeniería Genética Tecnología del ADN Fármacos Anti-cáncer Diagnósticos Cultivo de Células Vegetales Transferencia de genes en animales Síntesis de Sondas de ADN Localización desórdenes genéticos Clonación Solución de crimenes BIOTECNOLOGÍA Producción de Proteínas humanas Terapia Génica Bancos de ADN, ARN Proteínas Mapas de Genomas completos Biología Molecular Cultivos Celulares Anticuerpos Monoclonales Síntesis de Nuevas Proteínas Nuevos Antibióticos Nuevas Plantas y Animales Alimentos Recursos humanos químicos raros BIOTECNOLOGÍA

GENÓMICA Es el estudio del genoma y su acción. Tecnología del ADN El genoma es la suma total del material genético presente en un organismo particular, incluye el ADN presente en los cromosomas y en los organelos subcelulares (ej., mitocondrias) y el genoma de ARN de algunos virus. El anuncio el 26 de junio de 2000, del borrador del genoma humano en un 90%, marcó un hito histórico para la humanidad. IBM SP Supercomputadora

Tecnología del ADN: GENÓMICA Métodos utilizados en la genómica incluyen: Genómica Estructural. Estudio de que secuencias de genes están presentes dentro del ADN de un organismo. Genómica Funcional. El estudio de que funciones son conferidas a un organismo por una secuencia génica dada. Genómica Química. Se usa para comparar dos organismos de la misma especie (uno de los cuales tiene un gen o genes inactivados por un químico específico o una mutación puntual. Análisis de la Expresión Génica. Se usa para determinar el producto o productos producidos (tales como una enzima u otra proteína crítica). Cuando un determinado gen es activado, se mide la fluorescencia de las moléculas de ARN mensajero (ARNm) individual, cuando este ARNm hibridiza (con piezas de ADN correspondientes a las proteínas producidas/analizadas, que están adheridas a la superficie de hibridización sobre un biochip).

GENOMAS Tecnología del ADN IDENTIDAD GENÉTICA El genoma de un organismo es el juego completo de ADN. La planificación del Proyecto Genoma Humano se inició en 1986, previsto para el 2007. En Junio de 2000 se presentó el 90% del borrador con la secuenciación de unos 30,000 genes y 3 mil millones de pares de bases (pb). Los genes son secuencias específicas de bases que codifican instrucciones para hacer proteínas. Los genes son un 2% del genoma humano. Entre una persona y otra el ADN solo difiere en 0.2% 60% IDENTIDAD GENÉTICA De 289 genes humanos implicados en enfermedades, hay 177 cercanamente similares a los genes de Drosophila. 20% 70% 95% idéntico Humanos 30,000 genes Chimpancé 30,000 genes Ratón 30,000 genes A. thaliana 25,000 genes C. elegans 19,000 genes D. melanogaster 13,000 genes R. ALEGRÍA CONACYT 2002

presentó la secuencia del genoma Tecnología del ADN: GENOMAS VEGETALES El 14 de diciembre de 2000, se presentó la secuencia del genoma completo de la primera especie vegetal la Arabidopsis thaliana. El 26 de enero de 2001, el borrador de la secuencia del arroz (Orizae sativa). El funcionamiento de los genes en el arroz se aplicaría a cultivos principales, tales como trigo (Triticum spp) y maíz (Zea mays) con genomas mas grandes y más dificiles de secuenciar. El arroz es el genoma mas simple y pequeño de los genomas de todos los cereales, tiene 50,000 genes, dos veces el de Arabidopsis, y 12 cromosomas comparado con cinco de Arabidopsis.

Tecnología del ADN: GENOMAS VEGETALES Microarreglo o Biochip con secuencias de 11.500 genes hibridados con ARNm de Arabidopsis thaliana obtenidas antes (fluorescencia verde) y después (fluorescencia roja) del ataque del hongo Erysiphe cichoracearum. Las flechas indican genes que se han expresado en respuesta al patógeno. Un punto rojo significa “expresión incrementada”, un punto amarillo “igual expresión”, uno verde “expresión disminuida” y uno negro “ausencia de expresión”. Unos 70a genes han variado su nivel de expresión luego del ataque del patógeno. La información será usada para comprender los mecanismos de defensa involucrados. El análisis se realiza mediante computadoras que identifican los genes candidatos y proveen toda la información disponible sobre los mismos. El microordenamiento ha sido impreso en vidrio cuyo tamaño real es de 22 x 40mm. El inserto muestra una ampliación de tres bloques del microordenamiento conteniendo 360 genes cada uno (www.cienciahoy.org) R. ALEGRÍA CONACYT 2002

La Compañía SYNGENTA (suiza), ha demostrado Tecnología del ADN: GENOMAS VEGETALES La Compañía SYNGENTA (suiza), ha demostrado la utilidad de la genomica al utilizar la secuencia QTL 21 del cromosoma 1 del genoma del maíz (el cual fomenta la producción de la planta), encontrando un arreglo y orden de genes bastante similar con el existente en la variedad japonica o Nipponbare del arroz que ellos secuenciaron. Pamela Ronald, Fitopatóloga Vegetal de la Universidad Davis de California, usando una secuencia de la variedad de arroz indica, secuenciada por el Instituto de Genómica de Beijing y el Centro de Genoma de la Universidad de Washington, identificó un gen de resistencia a las enfermedades en arroz, cuya característica fenotípica ha sido usada por cientos de años por los fitomejoradores sin conocer su procedencia genética. R. ALEGRÍA CONACYT 2002

En la 14th International Genome Secuencing and Analysis Conferen- Tecnología del ADN: GENÓMICA FUTURA En la 14th International Genome Secuencing and Analysis Conferen- ce (oct. 2002), US Genomics Inc., presentó un aparato que lee la doble hélice de ADN sin cortarlo. Abre la doble hélice espiral de ADN, la lineariza y la pasa por un escaner para leerla en un lector fijo (como una pélicula de carrete pasa por un proyector), las moléculas se mueven a 30 M de bases por minuto. En 40 minutos se pueden Leer 3 mil M de bases. Si el sistema se logra pasar a un biochip el tiempo bajará a menos de cinco minutos, por la habilidad de capturar un Terabyte (1024 o 1000 gigabites, un gigabite = 1024 o 1000 Megabites) de información cada pocos segundos.(Uehling, M. D, Bio-It World Nov. 12 2002).

BASES MOLECULARES DE LA VIDA ADN ADN ARN PROTEÍNAS genoma Célula cromosomas genes los genes contienen instrucciones para hacer proteínas ADN las proteínas actúan solas o en complejos para realizar las funciones celulares BASES MOLECULARES DE LA VIDA ADN ADN ARN PROTEÍNAS

ESTRUCTURA DE UN GEN Tradicionalmente, un gen se ha Molécula de ADN ESTRUCTURA DE UN GEN Tradicionalmente, un gen se ha definido como un segmento de ADN que codifica para un polipéptido o para una molécula funcional de ARN. Recientemente, los nuevos descubrimientos han alterado radicalmente esta visión, para adoptar una definición más vaga. De acuerdo con ello, un gen es una secuencia de ADN genómico o de ARN que es esencial para especificar una determinada función. Para llevar a cabo su función el gen no necesita ser traducido a proteína, y a veces ni siquiera necesita ser transcrito. R. ALEGRÍA CONACYT 2002

ESTRUCTURA DE UN GEN Elementos típicos: 1) región reguladora promotor basal (caja TATA). sitios de unión de proteinas reguladoras (upstream promoter). Realzadores (enhancers) Silenciadores 2) sitio de inicio de transcripción. 3) 5'UTR. 4) codón de inicio. 5) intrones y exones alternados, con sitios de procesamiento aceptores y donadores 6) Codón de paro. 7) 3'UTR. 8) señal de poli-adenilación. R. ALEGRÍA CONACYT 2002

ESTRUCTURA DE UN GEN < 100 Kb Promotores Exones Sitio de inicio de la Transcripción Sitio de terminación de la Transcripción Realzadores < 100 Kb Los promotores pueden ser genéricos o tejido específico La función del gen depende de los FACTORES de TRANSCRIPCIÓN (FT) que activan a las ARN pol. Los FT son: los Factores de Transcripción General (se unen a secuencias promotoras genéricas) y los Activadores de Transcripción (se unen a secuencias promotoras específicas). Los FT pueden activarse o desactivarse en respuesta a estímulos del entorno del organismo. Intrones

INGENIERÍA GENÉTICA O ADNr La Ingeniería Genética o tecnología del ADNr se inició en la década de los 70s. Se refiere a un grupo de tecnologías usadas para cambiar la composición genética de las células y mover genes a través de las fronteras de las especies para producir nuevos organismos. Se pueden aislar genes, modificarlos, introducirlos a nuevos hospederos, y clonarlos para obtener una ventaja novedosa sobre el organismo natural.

INGENIERÍA GENÉTICA: TÉCNICAS DEL ADN RECOMBINANTE (ADNr) PROPÓSITO Enzimas de Restricción Cortan ADN en puntos específicos, hacen fragmentos de ADN ADN Ligasa Une fragmentos de ADN Vectores Virus o fagos: llevan ADN a las células y aseguran replicación Plasmidos Clase común de vector Marcadores Genéticos Identifican a las células que han sido transformadas PCR Amplifica la cantidad de ADN de muestras pequeñas ADNc Hace una copia de ADN de ARN mensajero Sondas de ADN Para identificar y marcar una pieza de ADN conteniendo cierta secuencia Síntesis Génica Para hacer un gen de una base de datos Gel Electroforésis Para separar fragmentos de ADN Secuenciación de ADN Para leer la secuencia de bases de un segmento de ADN

Transcriptasa reversa TÉCNICAS DEL ADNr: ENZIMAS PARA LA MANIPULACIÓN DEL ADN Enzimas de restricción ADN polimerasas ARN polimerasas Nucleasa ADN ligasa Kinasa Fosfatasa Transcriptasa reversa R. ALEGRÍA CONACYT 2002

DE TRANSFERENCIA GENÉTICA Técnicas del ADNr: SISTEMAS DE TRANSFERENCIA GENÉTICA 1. Agrobacterium. Uso de la bacteria Como "Ingeniero Genético". La bacteria conteniendo el inserto, infecta las células de la planta produciendo la recombinación genética. 2. Acelerador de Partículas (Gene Gun). Un cañón artificial bombardea micropartículas con el inserto, sobre la célula. 3. Electroporación. Uso de carga eléctrica para que el ADN atraviese la membrana nuclear. 4. Polietilenglicol. Exposición de las membranas al PEG, facilita el movimiento de las moléculas de ADN. 5. Silicon Wiskers. Inyección con fibras microscópi-cas, que atraviesan las membranas con los insertos. R. ALEGRÍA CONACYT 2002

DE TRANSFERENCIA GENÉTICA Técnicas del ADNr: SISTEMAS DE TRANSFERENCIA GENÉTICA 6. Microinyección. Una célula es adherida a una pipeta bajo un microscopio y el ADN foráneo es inyectado directamente en el núcleo usando una micropipeta muy fina. Se usa cuando hay pocas células disponibles, tales como células fertilizadas de huevo animal. 7. Liposomas. Los vectores pueden ser encapsulados en pequeñas vesículas de membrana para introducir el ADN in vivo en la célula. R. ALEGRÍA CONACYT 2002

DE TRANSFERENCIA GENÉTICA Técnicas del ADNr: SISTEMAS DE TRANSFERENCIA GENÉTICA En 1999 se usaron agujas de vidrio huecas con puntas de 1μm de diámetro, bajo la guía de un microscopio para inyectar ADN directamente en cloroplastos. Dichas puntas finas no dañan la membrana del cloroplasto, pero es requerida una alta presión para sacar el ADN de la aguja. El control del flujo de ADN bajo alta presión es un problema práctico significativo, que ha sido superado introduciendo un metal líquido en la aguja atrás del ADN. Cuando la aguja es calentada el metal se expande forzando al ADN a salir de manera controlada. Los investigadores también han usado esta misma técnica para introducir ADN en bacterias individuales y núcleos de células eucarióticas (www.ncbe.reading.ac.uk/NCBE/PROTOCOLS/DNA/PDF/DNA 01).

Nicotiana tabacum (tabaco), Orizae sativa (arroz) y Ingeniería Genética: MODELOS VEGETALES Las plantas que se usan como modelos de aprendizaje en Ingeniería Genética Vegetal son: Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum (tabaco), Orizae sativa (arroz) y Solanum tuberosum (papa). Estos modelos son útiles para “aprender haciendo” y ayudar a resolver problemas identificados por los agricultores nacionales, mientras se capacitan los miembros de los Centros o Unidades de Investigación que se quieran preparar. R. ALEGRÍA CONACYT 2002

Ingeniería Genética NUEVAS PLANTAS ARROZ con altos niveles de tolerancia a diferentes condiciones ambientales de estrés. Se insertaron dos genes fusionados de trehalosa de E. Coli y un promotor tejido específico dependiente del estrés. Los genes de trehalosa permiten la producción de arroz aún si está estresado por frio, sequía o altos niveles de salinidad e incrementa la producción en 20%. La composición química de los granos no cambia. El azúcar trehalosa ayuda a estabilizar moléculas biológicas: lípidos, enzimas y otras proteínas, en organismos en condiciones de estrés (PNAS Online, 27 nov. 2002).

Ingeniería Genética NUEVOS ANIMALES 1987 secreción de Beta-lactoglobulina en leche de ratón. Producción de proteína C humana en leche de cerdos, para desórdenes como hemofilia. Hormonas de crecimiento humano en tejido seminal de cerdo. Antitrombina humana III, anti- coagulante sanguíneo secretada en leche de cabras transgénicas. Cabras transgénicas para producir BioSteel fibra hecha por el hombre con propiedades de tela de araña.

ARROZ DORADO con beta caroteno de Ingeniería Genética NUEVOS ALIMENTOS Salmón transgénico por hormona de crecimiento. Producido por AF Protein Inc. cuenta con el promotor de la proteína de anticongelamiento de otra especie de pez. Crece de 4 a 6 veces más rápido que un salmón no transgénico. Tiene un 20% en mejoramiento de la eficiencia de conversión del alimento. ARROZ DORADO con beta caroteno de genes de narciso y de Erwinia uredovora, pigmentos que se transforman en pro- vitamina A al ser ingeridos. ARROZ fortificado con un gen de la ferritina. ARROZ con aa esenciales. (ISB, 2001, oct; Netlink, 2000).

Ingeniería Genética NUEVOS FÁRMACOS PAPA con la vacuna que previene la insulina dependencia de la diabetes mellitus 100 veces más poderosa que la actual vacuna. PAPA con la sub-unidad B antigénica de la enterotoxina del Vibrio cholerae causante del cólera). FRIJOL de SOYA con anticuerpos que protegen contra el virus 2 de Herpes simplex (HSV). TABACO con anticuerpos que previenen la caries dental producida por Streptococcus mutans.

CLONACION Ingeniería Genética Término genérico para la replicación en un laboratorio de genes, células u organismos de una entidad original, con copias genéticas exactas del gen, célula u organismo original. Esta técnica ha producido avances sensacionales en medicinas y vacunas. También hay investigación en clonación de células humanas, órganos y otros tejidos. Esto puede producir el reemplazo de piel, cartilagos y hueso para victimas de quemaduras y accidentes, o de órganos. R. ALEGRIA CONACYT 2002

BIOTECNOLOGÍAS PROMISORIAS Entre las Biotecnologías promisorias para el desarrollo productivo de El Salvador están: Tecnologías Moleculares para diagnóstico de enfermedades infecciosas, ii) Bioinformática, iii) Genómica, iv) Modificación Genética de Cultivos, v) Tecnologías recombinantes para hacer productos terapeúticos, vi) Bioremediación, vii) Química combinatoria (COMBICHEM) , viii) Bio-nanotecnología. (Top 10 Biotechnologies for Improving Health in Developing Countries: www.utoronto.ca/jcb)

¡MUCHAS GRACIAS POR SU ATENCION¡ www.conacyt.gob.sv ¡MUCHAS GRACIAS POR SU ATENCION¡ Atentamente: ROBERTO ALEGRIA ralegria@conacyt.gob.sv