Ingeniería de vías metabólicas en bacterias para producción de compuestos aromáticos de interés industrial Dr. Adelfo Escalante. Investigador Titular Departamento de Ingeniería Celular y Biocatálisis, Instituto de Biotecnología, UNAM. adelfo@ibt.unam.mx

Definiciones Biotecnología: una serie de procesos por los cuales un organismo es manipulado, particularmente a nivel genético para la obtención de productos de interés.

Producción Producto de interés Análisis in silico Ingeniería de vías metabólicas Producción Selección del microorganismo productor Cepa (sobre) productora (modificada genéticamente) Producto de interés Datos -ómicos Fermentación y downstream porcesses

Ingeniería de Vías Metabólicas Modificación directa de las propiedades celulares a través de la modificación de reacciones bioquímicas específicas o la introducción de otras nuevas, por medio del uso de la tecnología del ADN recombinante

central de carbono y vía de síntesis aromáticos en E. coli JM101 Piruvato Vía de las pentosas fosfato Glucosa PTS Glucosa-6-P Transcetolasa I tktA Glucólisis Vía de síntesis de aminoácidos aromáticos Eritrosa-4-P 2 Fosfoenol piruvato DAHP DHQ DHS SHK DAHP Sintasa aroF, aroG, aroH 3-Dehidroquinato Sintasa aroB 3-Dehidroquinato deshidratasa aroD Shikimato deshidrogenasa aroE Shikimato cinasa I y II aroK, aroL Fosfoenolpiruvato sintasa ppsA Piruvato cinasa I y II pykF, pykA SHK-3-P 3-Fosfoshikimato- 1-carboxivinil transferasa aroA Piruvato EPSHK-3-P Corismato sintasa aroC TCA Corismato Triptofano Metabolismo central de carbono y vía de síntesis aromáticos en E. coli JM101 Fenilalanina Tirosina

Figure 2 CHA ANT L-TRP Indole-3-pyruvic acid imine vioA vioB vioE Protodeoxyviolacein acid vioD vioC vioC L-PHE PRE Deoxyviolacein Violacein PAL Malonate Cinnamic acid ldh hpaBC matC 4CL 4-Hydroxyphenylacetate HPP Salvianic acid Malonate Cinnamoyl-CoA 3,4-Dihydroxyphenylpyruvate hpaBC matB Malonate CHS ldh CHS Malonyl-CoA Pinocembrin chalcone matC Malonate CHI matB 2S-Pinocembrin Malonyl-CoA L-TYR 4-Coumaric acid Coumaroyl-CoA TAL 4CL Coum3H Sam5 Coum3H Caffeic acid Caffeoyl-CoA STS Thioesterase COM Resveratrol Ferulic acid Figure 2

Shikimato, precursor para la síntesis de oseltamivir fosfato SHK Proceso de síntesis química Oseltamivir fosfato: Inhibidor de la neuraminidasa tipo I (NI) de virus de influenza estacional A y B, Virus de influenza aviar (H5N1) y de virus de influenza humana A(H1N1) y A(H3N2)

Mecanismo de infección de virus de influenza e inhibición de neuraminidasas por OSF HA NA Gemación AS Corte de receptores de AS por NA Endosoma RNA viral Inhibidores de NA Núcleo Cortés-Tolalpa et al. 2011. Biotecnología. 15(1) Célula blanco

Producción de OSF a partir de shikimato (2-7% en frutos de anís estrella chino) Anís estrella chino (Illicium sp) OSF

Extracción de SHK a partir de caldos de fermentación (ALM) Ingeniería de vías metabólicas en E. coli para la producción de shikimato por sistemas de fermentación. Ante la necesidad de contar con estrategias propias de producción de compuestos antivirales (OSF): Construcción de cepas de E. coli sobreproductoras de SHK y evaluación en fermentador (FBZ-AE) Extracción de SHK a partir de caldos de fermentación (ALM) Escalamiento del proceso (OTR) Desarrollo de un proceso alternativo de síntesis de OSF (MO, UAEM)

Piruvato Vía de las pentosas fosfato Glucosa PTS Glucosa-6-P Transcetolasa I tktA Glucólisis Vía de síntesis de aminoácidos aromáticos Eritrosa-4-P 2 Fosfoenol piruvato DAHP DHQ DHS SHK DAHP Sintasa aroF, aroG, aroH 3-Dehidroquinato Sintasa aroB 3-Dehidroquinato deshidratasa aroD Shikimato deshidrogenasa aroE Shikimato cinasa I y II aroK, aroL Fosfoenolpiruvato sintasa ppsA Piruvato cinasa I y II pykF, pykA SHK-3-P 3-Fosfoshikimato- 1-carboxivinil transferasa aroA Piruvato EPSHK-3-P Corismato sintasa aroC TCA Corismato Triptofano Metabolismo central de carbono Fenilalanina Tirosina

JM101 (silvestre)  = 0.71 PB11 PTS- Glc-  = 0.11

JM101 (silvestre)  = 0.71 PB11 PTS- Glc-  = 0.11 PB12 PTS- Glc+  = 0.4

JM101 (silvestre)  = 0.71 CITOPLASMA PERIPLASMA PB11 PTS- Glc-  = 0.11 OmpC OmpF Glucosa Glucosa LamB PB12 PTS- Glc+  = 0.4 Glucocinasa H+ Gluc-6-P Glucosa + H+ GalP ADP ATP

central de carbono y vía de síntesis aromáticos en E. coli PB12 Vía de las pentosas fosfato Glucosa GalP Glucosa-6-P Glucocinasa glk Transcetolasa I tktA Eritrosa-4-P 2 Fosfoenol piruvato DAHP DHQ DHS SHK DAHP Sintasa aroF, aroG, aroH 3-Dehidroquinato Sintasa aroB 3-Dehidroquinato deshidratasa aroD Shikimato deshidrogenasa aroE Shikimato cinasa I y II aroK, aroL Fosfoenolpiruvato sintasa ppsA Piruvato cinasa I y II pykF, pykA SHK-3-P 3-Fosfoshikimato- 1-carboxivinil transferasa aroA Piruvato EPSHK-3-P Corismato sintasa aroC TCA Corismato Triptofano Metabolismo central de carbono y vía de síntesis aromáticos en E. coli PB12 Fenilalanina Tirosina

Inactivación sencilla de Vía de las pentosas fosfato Glucosa GalP Glucosa-6-P Transformación c/ pTOPOaroB aroE Glucocinasa glk Transcetolasa I tktA Transformación c/ pJLBaroGfbr tktA [Eritrosa-4-P]  [Fosfoenol Piruvato]  [DAHP]  [DHQ] DHS [SHK] DAHP Sintasa aroF, aroG, aroH 3-Dehidroquinato Sintasa aroB 3-Dehidroquinato deshidratasa aroD Shikimato deshidrogenasa aroE Fosfoenolpiruvato sintasa ppsA Inactivación sencilla de Piruvato cinasa I o II pykF, pykA Piruvato TCA

Cultivos de 500mL: Medio mineral + 25 g/L glucosa + 15 g/L extracto de levadura 37°C 500 rpm 20% de OD 10 mM IPTG Cultivos 50 h Cuantificación: Biomasa Consumo de glucosa Producción de DAHP, DHS, SA, GA