Cromatografía Técnica bioquímica en la que sustancias mezcladas se separan en función de su carga, hidrofobicidad, tamaño o alguna otra propiedad, al repartirse entre una fase móvil y una fase estacionaria Volumen de columna Muestra aplicada Matriz Tapón poroso Eluyente Proteínas separadas

Matriz de la columna: (Fase estacionaria o lecho de la columna) Matriz de la columna: (Fase estacionaria o lecho de la columna). Matriz ó sustancia empaquetada en la columna que está empapada de solvente. Fase Móvil. Solución tamponada que pasa a través de la columna. Longitud del dispositivo en el que se empaqueta la columna: Es importante en algunos tipos de cromatografía como la de filtración en gel y poco importante en otras como la cromatografía de afinidad. Volumen de la columna. (Geométrico) Volumen total de la matriz ó gel que se empaqueta en una columna cromatográfica. Volumen muerto de la columna. Cantidad de solvente que tiene que atravesar la columna para asegurar que se ha reemplazado completamente.

Cromatografía de exclusión molecular ó filtración en gel PRINCIPIO: Separación en función del tamaño TIPOS DE MATRIZ: Perlas de polímeros entrecruzados con poros de un tamaño determinado Dextranos entrecruzados Agarosa Poliacrilamida

Cromatografía de exclusión molecular ó filtración en gel PRINCIPIO: Tamaño de partícula y masa molecular. Mayor masa molecular eluye primero El gel retiene particuas de menor masa molecular

FASE ESTACIONARIA En esta práctica se utilizará el matriz-gel dextrano. Tipo Peso molecular Límite de fraccionamiento (daltons) Agua retenida (g/g gel sec) Volumen de gel hidratado (ml/g gel seco) G10 Hasta 700 1.0 2 G15 Hasta 1500 1.5 3 G25 1000 - 5000 2.5 5 G50 1500 - 30 000 5.0 10 G75 3000-80 000 7.5 12-15 G100 4000 - 150000 10.0 15-20 G150 5000 – 400 000 15.0 20-30 G200 5000 – 800 000 20.0 30-40

APLICACIONES Desalado de proteínas Purificación de proteínas Eliminación de productos, cofactores, inhibidores, etc. de enzimas. Separación de compuestos de diferente masa molecular a la proteína de interés. Determinación de la masa molecular de proteínas Cambios de buffers posterior a otra cromatografía

Desventajas: No se pueden obtener fracciones de proteínas altamente purificadas si se parte de una mezcla compleja de proteínas

Extractos proteicos Cromatograma Detección de proteína

Perfil de elución de extractos proteicos de 0, 12 y 24 h de germinación de maíz

Equipos para Cromatografía de Filtración en gel

Ejercicio: Mezcla de proteínas Conalbúmina + Ferritina MW (kDa) 75 440

FASE ESTACIONARIA Tipo Masa molecular Límite de fraccionamiento (daltons) Agua retenida (g/g gel sec) Volumen de gel hidratado (ml/g gel seco) G10 Hasta 700 1.0 2 G15 Hasta 1500 1.5 3 G25 1000 - 5000 2.5 5 G50 1500 - 30 000 5.0 10 G75 3000-80 000 7.5 12-15 G100 4000 - 150000 10.0 15-20 G150 5000 – 400 000 15.0 20-30 G200 5000 – 800 000 20.0 30-40

NaCl Ferritina Conalbúmina Proteína MW (kDa) Conalbúmina 75 Ferritina 440 NaCl 0.058 NaCl Ferritina Conalbúmina

Ejemplo:

¿ Existen otros métodos para DESALAR muestras proteicas?

Ejercicio: Dibuja el cromatograma esperado de la mezcla de proteínas e indica el orden de elución. Proteína MW (kDa) Ve (mL) Orden de elución Conalbúmina 75 73 Ferritina 440 67 Aldosa 158 61 Ovoalbúmina 44 52 GDH 600 49 Ve, volumen de elución.

Å kDa MASA TAMAÑO