Plantas transgénicas Propósito 1. Investigación básica ► Regulación de la expresión (promotores) ► Estudio funcional de genes ● Complementación ● Expresión ● Silenciamiento 2. Investigación aplicada Generación de líneas de mayor rendimiento agrícola o forestal ► Número, tamaño y calidad del producto ► Resistencia a plagas (↓ pesticidas) ► Tolerancia a estrés abiótico (sequía, salinidad, frío, nutrientes) Bioreactores Genes introducidos Especies distantes Especies relacionadas Variedades de la misma especie (diversidad) Misma especie (cambio en los patrones de expresión)

1.Electroporación de protoplastos 2.Agrobacterium tumefaciens 3.Bombardeo con micropartículas 4.Virus modificados Estrategias para la introducción de genes en plantas  Transformación estable → Organismos transgénicos Basadas en la capacidad de generar un organismo completo a partir de una célula (TOTIPOTENCIA) ► Organogénesis ► Embriogénesis  Transformación transitoria

Agrobacterium tumefaciens Sistema natural de transferencia de genes foráneos al genoma de las plantas → Plásmido Ti

Plásmido Ti 1. T-DNA (insertado en genoma de la célula vegetal) Opinas: Derivados de la arginina Utilizadas por A. tumefaciens como fuente de C, N y energía Hormonas vegetales (oncogenes) Auxina Citoquinina 2. Resto del plásmido Genes de virulencia Funciones bacterianas (conjugación, resistencia a fagos, origen) Catabolismo de opina

opina Proliferación de agrobacteria en suelo Formación de tumores y liberación de opinas por la planta al suelo Ventaja para el crecimiento de Agrobacterium sobre otras bacterias

Transferencia de T-DNA de la bacteria a la planta

¿Cómo aprovechar este sistema natural de transferencia de DNA para introducir genes de interés? 1.Cointegración Generación de vectores “lanzadera” (shuttle) recombinantes ►Elementos plásmido de E. coli ► T-DNA ► Marcador para selección de agrobacteria (Amp) ► Marcador para selección en plantas (Kan) ► Sitio de clonamiento

2.Sistema binario Separación de funciones cis (T-DNA) y trans (genes vir) de plásmidosTi Agrobacterium

Verificar expresión mRNA (Northern blot) Proteína (Western blot, actividad) Generación de plantas transgénicas por transformación ESTABLE con A. tumefaciens

Bombardeo con micropartículas

Comparación entre métodos de transformación A.tumefaciensBombardeo Pocas copias integradasMuchas copias integradas Poco control de integraciónAlgún control de integración (organelas) Integridad de copiasCopias fragmentadas Rango limitado de plantasRango amplio de plantas No hay integración en DNA de organelasIntegración en DNA de organelas Fragmentos de tamaño limitadoFragmentos de mayor tamaño

Principales objeciones al uso de cultivos transgénicos para producción agricultura 1.Toxicidad 2.Transferencia no controlada de genes (transgenes, resistencia a antibióticos) ► Polen (polinización cruzada) ► Transferencia horizontal 3.Disminución de diversidad y empobrecimiento genético 4.Presión para el desarrollo de resistencia en plagas