CROMATOGRAFIA EN COLUMNA Mónica Gabriela Buenafé 200717818 Alma Irene Ulin Sapon 200817219 Edy Alfredo Jiménez Cayax 200819614 Irene Andrea Gutiérrez Alvarado 201021492

CROMATOGRAFIA EN COLUMNA La cromatografía es una técnica que permite la separación y purificación de los componentes de una mezcla debido a la influencia de dos efectos contrapuestos. Retención. Desplazamiento.

Retención: Efecto producido sobre los componentes de la mezcla por una fase estacionaria, que puede ser un sólido o un líquido anclado a una soporte sólido Desplazamiento: Efecto ejercido sobre los componentes de la mezcla por una fase móvil, que puede ser un líquido o un gas.

Elución: El fenómeno de migración de los compuestos de una mezcla a lo largo de la fase estacionaria, impulsados por la fase móvil, recibe el nombre de elución. La mezcla a separar se deposita sobre la fase estacionaría, mientras que la móvil atraviesa el sistema desplazando a los componentes de la mezcla a distinta velocidad, dependiendo de la magnitud de sus interacciones relativas con ambas fases.

Las dos fases se eligen de forma que los componentes de la muestra se distribuyan de modo distinto entre la fase móvil y la fase estacionaria. Aquellos componentes que son fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo de la fase móvil. por el contrario los componentes que se unen débilmente a la fase estacionaria, se mueven con rapidez. Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se separan en bandas o zonas discretas que pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente.

Separación en bandas o zonas discretas .

Las cromatografías son un grupo de técnicas de separación selectiva de moléculas, en las que los componentes de una mezcla compleja de componentes pueden ser identificados y/o purificados. Existen varios tipos de cromatografías, según los criterios que se usan para hacer los análisis, pero todas consisten de una fase estacionaria y una móvil. (Harris, 2007)

En la cromatografía en columna la separación se consigue haciendo fluir la mezcla a través de una columna de adsorbente. Los compuestos emergen de la columna a tiempos diferentes, y pueden ser recogidos en fracciones separadas. (Harris, 2007)

Los elementos estándar de una columna cromatográfica incluyen un material sólido y poroso (matriz) que se deposita en el interior de una columna hecha generalmente de plástico o vidrio. A través de la matriz, la fase estacionaria fluye una disolución, la fase móvil. La disolución que sale de la columna por la parte inferior (el efluente), es reemplazada constantemente por disolución suministrada de un deposito en la parte superior, la disolución (especialmente de proteínas) a separar se deposita sobre la cabeza de la columna y se deja percolar hacia el interior de la matriz sólida. Se añade más disolución sobre ella.

La disolución de proteínas forma una banda dentro dela fase móvil que tiene inicialmente la anchura de la disolución de proteína aplicada a la columna. A medida que las proteínas se desplazan a través de la columna, se retarda en diferentes grados según sus diferentes interacciones con el material de la matriz. La banda de proteínas se ensancha así a medida que se mueve a través de la columna. (Nelson, 2009).

La separación mejora (aumenta la resolución) a medida que aumenta la longitud de la columna. Sin embargo cada banda de proteína individual también se ensancha con el tiempo debido a la difusión, un proceso que disminuye la resolución.

Términos para una columna cromatográfica. matriz de la columna. Sustancia que está empapada de solvente y que  se empaqueta en la columna. También se denomina el lecho de la columna.  longitud de la columna. Longitud del dispositivo en el que se empaqueta la columna. volumen de la columna. Volumen total de gel que se empaqueta en una columna cromatográfica. volumen muerto de la columna. Cantidad de solvente que tiene que   atravesar la columna para asegurar que se ha reemplazado completamente. (Harris, 2007).

Elección del disolvente. Se lleva a cabo una cromatografía en capa fina de la muestra a analizar. El disolvente debe producir una buena separación de los componentes de la mezcla en la placa, colocando el componente menos polar a un Rf cercano a 0.3. En el caso de columnas pequeñas, lo ideal es usar un eluyente menos polar que el conseguido en el resultado de la cromatografía en placa.

Hexano Tolueno Diclorometano Cloroformo Dietil éter Acetato de etilo Acetona 1-Propanol Etanol Metanol Agua Comúnmente se suele usar como adsorbente alúmina o sílice. Las fases móviles se usan en función de la polaridad de los compuestos a separar. lista de menor a mayor polaridad de las fases móviles comúnmente usadas: 

Tiempo de retención El tiempo que se necesita para hacer fluir un compuesto por la columna, se conoce con el nombre de tiempo de retención. Este tiempo varía, siendo característico de cada compuesto en una condiciones cromatográficas determinadas, que varían según el absorbente usado, el disolvente, la presión, el diámetro que tenga la columna utilizada, etc.

Tipos de Cromatografías: Cromatografía Liquida de alta eficiencia o rendimiento (HPLC). Cromatografía de intercambio iónico.  Cromatografía por Permeabilidad en Gel.  Cromatografía de Afinidad. 

Cromatografía Liquida de alta eficiencia o rendimiento (HPLC). Es una Cromatografía de alta presión es decir se aplica el flujo a presión (entre 1500 a 2200 psi). El tamaño de partícula es entre 3 y 10 micras, la longitud de la columna es entre 5 y 25 cm. y requiere de equipo sofisticado. Se pueden analizar muestras proteicas. La reducción del tiempo en que la sustancia se encuentra en el interior de la columna, limita el ensanchamiento por difusión de las bandas, aumentando por tanto la resolución. 

Cromatografía de intercambio iónico En proteínas la cromatografía de intercambio iónico se basa en las diferencias en signo y magnitud de la carga eléctrica neta de las proteínas a un valor de pH determinado. La Fase Estacionaria  es una resina de intercambio iónico que contiene grupos cargados, teniendo la propiedad de separar especies ionizadas (Cationes o Aniones); la Fase Móvil es generalmente una solución amortiguadora de pH.

Cromatografía de intercambio iónico La afinidad de cada proteína a los grupos cargados de la columna esta influenciada por el pH y por la concentración de iones en solución (concentración salina) que compiten con la proteína en la interacción con la matriz. La separación de la proteína de la matriz cargada puede obtenerse gradualmente cambiando el pH y/o la concentración salina de la fase móvil, de tal forma que se genere un gradiente de concentración.

Cromatografía por Permeabilidad en Gel. Es útil para la separación de proteínas. La Cromatografía de exclusión molecular, también llamada de filtración en gel, separa en función de su tamaño. La matriz de la columna esta formada por un polímero entrecruzado con poros de tamaños determinados. Las proteínas de mayor tamaño migran más deprisa a lo largo de la columna que las de pequeño tamaño, debido a que son demasiado grandes para introducirse en los poros de las bolas de polímero y por tanto siguen una ruta más corta y directa a lo largo de la longitud de la columna.

Cromatografía por Permeabilidad en Gel. Las proteínas de menor tamaño, entran en los poros y su marcha a lo largo de la columna es más lenta. (Nelson, 2009)

Cromatografía de Afinidad. La Cromatografía de Afinidad permite la separación de mezclas proteicas por su afinidad o capacidad de unión a un determinado ligando. En este caso, las proteínas que se retienen en la columna son aquellas que se unen específicamente a un ligando que previamente se ha unido covalentemente a la matriz de la columna. Después de que las proteínas que no se unen al ligando son lavadas o eluidas a través de la columna, la proteína de interés que ha quedado retenida en la columna se eluye o libera mediante el empleo de una solución que contiene bien ligando libre u otro compuesto que rompa la interacción entre el ligando y la proteína.

La cromatografía de afinidad tiene una serie de características generales que la distinguen de otros tipos de cromatografía líquidas. Alta selectividad en el mecanismo de retención Campo de aplicación restringido Separación de un solo soluto analito Empleo de sistema de baja presión Columnas cortas de escasa eficacia cromatográfica. (Robinson, 2001)

Ligandos de Afinidad. Son las moléculas bioquímicas que se encuentran ancladas químicamente sobre el soporte sólido inerte, y son las responsables de la adsorción específica de los solutos-analitos.

Clasificaciones de ligandos de afinidad Según su naturaleza, pueden ser macromoléculas biológicas o bien moléculas de bajo peso molecular de biomoléculas pequeñas o macromoléculas bioquímicas, respectivamente. Y según su actuación. Que se fundamenta en la selectividad en la retención que condiciona las características de la cromatografía de afinidad.

Se distinguen dos grandes grupos: Ligandos específicos , como los anticuerpos , que se enlazan reversiblemente a un solo soluto. los ligandos generales enlazados con un determinado grupo de compuestos bioquímicos, como las lectinas y nucleótidos. (Skoog, 2008).

Bibliografía Referencias Bibliográficas Harris, D. (2007) Análisis Químico Cuantitativo (3ª Ed.) España: Editorial Reverté Lehninger ( 2009 )“Principios de Bioquímica” Quinta Edición., Barcelona, Ediciones Omega, S.A Nelson, D., Cox, M. (2009) Lehninger Principios de Bioquímica (5ª Ed.) U.S.A.: W.H.Freeman and company Rubinson, R. (2001) Análisis Instrumental (3ª Ed.) México: Editorial Pretice Hall Skoog, H. (2008) Principios de Análisis Instrumental (8ª Ed.) España: Reverté  

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