Aterosclerosis y antioxidantes Prof. Claudio Aguayo Tapia Departamento de Bioquímica Clínica e Inmunología Facultad de Farmacia Universidad de Concepción Programa Estrategia Global Contra la Obesidad (EGO-UDEC)

Desarrollo de la Aterosclerosis

Equilibrio Redox El Estrés Oxidativo resulta del desbalance entre los niveles de especies Reactivas del Oxígeno (ROS) y los Antioxidantes (AOX). Bajo circunstancias normales, las células tienen la capacidad de balancear la producción de Oxidantes y Antioxidantes, resultando en un Equilibrio Redox. El estrés oxidativo ocurre cuando las células están sujetas a niveles excesivos de ROS, o como resultado de una reducción en los niveles de antioxidantes.

De negris et al., 2003 Trends Mol Med

STRESS OXIDATIVO FAD, flavin adenine dinucleotide COX, cyclooxygenases LOX, lipoxygenases cyt. P450, cytochrome P450 monooxygenases; nitric oxide (NO) synthases, NOS NADPH oxidase, nicotinamide adenine dinucleotide oxidase SOD, superoxide dismutases GP, glutathione peroxynitrite O2 superoxide anion ONOO, peroxynitrite.

Xantino Oxidasa Es expresada en el endotelio, células de la circulación y no en las células musculares lisas. En condiciones fisiopatológicas la XO es otra fuente importante de estrés oxidativo vascular. Madamanchi, et al., 2005 Arterioscler Thromb Vasc Biol.

Electron Spin Resonance Characterization of Vascular Xanthine and NAD(P)H Oxidase Activity in Patients With Coronary Artery Disease: Relation to Endothelium-Dependent Vasodilation Stephan Spiekermann, Ulf Landmesser, Sergey Dikalov, Martin Bredt, Graciela Gamez, Helma Tatge, Nina Reepschläger, Burkhard Hornig, Helmut Drexler and David G. Harrison En pacientes con enfermedad coronaria (CAD), se observa una activación de XO. En pacientes jóvenes asintomático con hipercolesterolemia familiar se ha detectado que el aumento de la XO endotelial. Circulation 2003;107;1383-1389

Óxido Nítrico Sintasa (eNOS)

Desacoplamiento de la Óxido Nítrico Sintasa Ubicación celular Membrana plasmática Plasmalema de caveola (Shaul 1996) Aparato Golgi (Sessa 1995) Fosforilación de eNOS Ser1177 Thr495 Interacción con proteínas Caveolina 1 Hsp 90 CaM NADPH FMN FAD

REGULACION DE eNOS INTERACCIONES PROTEÍNA- PROTEÍNA MODIFICACIONES POST-TRANSDUCCIONALES NOSIP eNOS CaV Dyn (-) PO4 -S(1177)– M Akt AMPK P L-ARG NO Hsp90 CaM Caveolae

Desacoplamiento de la Óxido Nítrico Sintasa Estructura y Función Normalmente la eNOS transfiere electrones a su sustrato la L-arginina para formar citrulina y NO. El desacoplamiento se produce en condiciones patológicas debido a una disminucion en la biodisponibilidad de BH4 o arginina. H4B Dominio reductasa

Desacoplamiento de eNOS y producción de O2- Xia, Journal of biological Chemistry. 1998

Desacoplamiento de eNOS y producción de O2- Xia, Journal of biological Chemistry. 1998

Oxidized low-density lipoprotein increases superoxide production by endothelial nitric oxide synthase by inhibiting PKCa Ingrid Fleminga, Annisuddin Mohameda, Jan Galleb, Ljudmila Turchanowac, Ralf P. Brandesa, Beate Fisslthalera, Rudi Bussea Cardiovascular Research 65 (2005) 897– 906

Förstermann et al., 2006 Circulation

NADPH Oxidasa Es la principal fuente de O2.- en la vasculatura. Clinical Science (2005) 109, 217–226

NADPH Oxidasa Clinical Science (2005) 109, 217–226

Steinberg and S. Grinstein 2005 Physiol Rew.

Factores Hemodinámicos shear stress Factores genéticos (Polimorfismo) Factores humorales (AII, PDGF, TNFa) Hipercolesterolemia, hipertensión, diabetes, insuficiencia cardiaca NADPH oxidasa O2- NO H2O2 +ONOO Biodisponibilidad del NO disminuida Activacion de genes sensibles al estado redox DISFUNCION ENDOTELIAL

p47phox is required for atherosclerotic lesion progression in ApoE–/– mice Patricia A. Barry-Lane,1 Cam Patterson,2,3 Marié van der Merwe,2 Zhaoyong Hu,1 Stephen M. Holland,4 Edward T.H. Yeh,5 and Marschall S. Runge2 Aortas de ratones p47phox(-/-) tienen menos lesiones ateroscleroticas Aortas de ratones p47phox (-/-) presentan menor contenido de 02- Barry-Lane et al 2001 J. Clin. Invest.

Guzik et al 2002 Circulation

Phagocytic NADPH Oxidase Overactivity Underlies Oxidative Stress in Metabolic Syndrome Ana Fortuno,1 Gorka San Jose´ ,1 Marý´a U. Moreno,1 Oscar Beloqui,2 Javier Dý´ez,1,3 and Guillermo Zalba1 DIABETES, VOL. 55, 2006

¿Stress oxidativo puede activar oncogenes en la pared arterial?

Evidence for Oxidative Activation of c-Myc–Dependent Nuclear Signaling in Human Coronary Smooth Muscle Cells and in Early Lesions of Watanabe Heritable Hyperlipidemic Rabbits: Protective Effects of Vitamin E F. de Nigris, T. Youssef, S.A. Ciafré, G.L. Condorelli, W. Palinski, and C. Napoli Circulation 2000; 102: 2111-2117.

Harrison, Circulation Reseach, 2000 Principales fuentes de especies reactivas del oxigeno (ROS) Harrison, Circulation Reseach, 2000

Palinski et al., 2003 Circulation

Increased Formation of Distinct F2 Isoprostanes in Hypercholesterolemia Muredach P. Reilly, MB; Domenico Pratico`, MD; Norman Delanty, MB; Giovanni DiMinno, MD; Elena Tremoli, PhD; Daniel Rader, MD; Shiv Kapoor, PhD; Joshua Rokach, PhD; John Lawson, MS; Garret A. FitzGerald, MD Circulation. 1998;98:2822-2828

STRESS OXIDATIVO Y FUNCIÓN ENDOTELIAL

Evolución de las enfermedades cardiovasculares B D A C Factores de riesgo Disfunción endotelial Aterosclerosis CAD Isquemia miocardica Trombosis coronaria La aterosclerosis puede ser considerada como una forma de inflamación crónica que sucede dentro de la pared arterial. Es un proceso multifactorial, que comienza en forma tan temprana como es la niñez y que presenta manifestaciones clínicas más tarde en la vida. Constituyen factores de riesgo: dislipidemias, diabetes mellitus, tabaquismo, hipertensión, hiperhomocisteinemia, etc. Infarto al miocardio Atherosclerotic disease is a progressive disease as shown in this slide. Many therapeutic interventions are aimed at specific cardiovascular conditions. These interventions may be directed at alleviating symptoms or preventing progression to more serious stages or both. Angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibitors have been studied, for example, in patients with hypertension, who are at the top of this progression pathway. These studies looked only at the effects on blood pressure, however, and did not address the long-term question of risk reduction. Other clinical trials with ACE inhibitors have been designed to investigate the effects of these agents on the morbidity and mortality following an acute myocardial infarction. Arritmias & pérdida músculo Remodelamiento Dilatación ventricular Falla cardiaca congestiva Estados finales 10

síntesis Oxido Nítrico Hipertensión Diabetes Tabaco LDL Homocisteina SM O2 Alteraciones en síntesis Oxido Nítrico H2O2 Endotelio ROS NO Biodisponibilidad de NO DISFUNCION ENDOTELIAL Crecimiento VSMC Apoptosis Depósitos lípidos Adhesión Leucocitos Vasoconstricción Trombosis

Test de FUNCION ENDOTELIAL: BIOMARCADOR DE ATEROSCLEROSIS Respuesta endotelial normal Endotelio Célula muscular lisa Test para evaluar la función endotelial Función endotelial Circulación coronaria 1.- Angiografía coronaria cuantitativa 2.- Doppler intracoronario 3.- Doppler ecocardiográfico 4.- Tomografía emisión de positrones 5.- Imágenes de resonancia magnética contrates de fase Circulación periférica 1.- FMD braquial Disfunción endotelial Test de FUNCION ENDOTELIAL: BIOMARCADOR DE ATEROSCLEROSIS

Arteria Arteria umbilical umbilical Ducto Vena Allantonico umbilical Epitelio Amniótico Gelatina Wharton`s Circulación fetal Arteria umbilical Vena umbilical Decidua Parietal Corion Liso Vasos Corionicos Ammio Citotrofoblasto Septo Placenta Miometrio Espacio Intevellosos Villus Vena Endometrial Arteria espiral Endometrial

Arteria umbilical Arteria umbilical Ducto Allantonico Vena umbilical Epitelio Amniótico Gelatina Wharton`s

Células endoteliales de vena umbilical humana en cultivo

síntesis Oxido Nítrico LDL O2 Alteraciones en síntesis Oxido Nítrico H2O2 Endotelio ROS NO

síntesis Oxido Nítrico LDL O2 Alteraciones en síntesis Oxido Nítrico H2O2 Endotelio ROS NO MARCADORES DE FUNCION ENDOTELIAL

Estudio del efecto de oxLDL sobre la viabilidad de células endoteliales humana

Producción de especies reactivas del oxigeno en células endoteliales humanas por efecto de oxLDL y nLDL

Producción de especies reactivas del oxigeno en células endoteliales humanas por efecto de oxLDL y nLDL Control 0.1 M DCF 1 M DCF 10 M DFC

Efecto de la oxidación de LDL sobre la biodisponibilidad del óxido nítrico en células endoteliales humanas.

Efecto de la oxidación de LDL sobre la biodisponibilidad del óxido nítrico en células endoteliales humanas. Control DAF-2DA DAF-2DA + ACH 5.0 M * * * 7.5 M 10 M

Efecto de oxLDL sobre la expresión de eNOS en células endoteliales humanas β-actina 350 pb 350 pb

Expresión de NADPH oxidasa en células endoteliales humanas p47phox p22phox p67phox

Señalización intracelular a través de proteínas kinasas p44P p42P oxLDL - + - + PD-98059 (10 µM) - - + +   p44P p42P oxLDL - - + + PTX (5 nM) - + - + p38P   oxLDL - + - + PTX (5 nM) - - + +

Oxido nítrico Bajo Colesterol DAF-2DA Alto Colesterol Alto HDL Ach Bajo HDL

Especies reactivas del oxígeno Bajo Colesterol DCF Alto Colesterol Alto HDL H2O2 Alto Colesterol Bajo HDL

Cinética de oxidación de LDL a distintas concentraciones de CuSO4 7 µM 5 µM 3 µM 1 µM 10 µM Blanco

Cinética de oxidación de LDL en presencia de plasma A.- Bajo Colesterol B.- Alto Colesterol Alto HDL C.- Alto Colesterol-Bajo HDL

Cinética de oxidación de LDL en presencia de plasma

? EPC Angiogenesis Vasculogenesis Vaso sanguíneo Factores Crecimiento Citoquinas hormona Isquemia Tumores Ovulación Inyección Migración EPC Derivadas MO Movilización ? EC in situ Diferenciación Proliferación EPC in situ EPC Angiogenesis Vasculogenesis Area Isquemica Medula Ósea (MO)

Historia familiar de CAD CD34+KDR+/PMNC (%) Células progenitoras de endotelio facilitan la homeostasis vascular y reendotelialización Células progenitoras de endotelio Control CAD CAD CAD estable inestable inestable Trop T Neg Trop T pos CD34+KDR+/PMNC (%) CD34+KDR+/PMNC (%) Edad Historia familiar de CAD CAD: Coronary artery desaese Fadini et al., 2005 J. Am. Coll. Cardiol.

CÉLULAS PROGENITORAS DE ENDOTELIO TEMPRANAS 4 días 7 días 14 días 25 días 10 días 15 días 17 días CÉLULAS PROGENITORAS DE ENDOTELIO TARDÍAS

2.- EPC tempranas (5 semanas) 3.- EPC tardías 4.- HUVECs 1 2 3 4 5 B 1 2 3 4 5 CD34 CD133 Oct-4 KDR Tie-2 β-actina CD31 Cav-1 β-actina 1.- EPC Tardías 2.- Mononucleares 3.- HUTECs 4.- HUVECs 5.- Control (-) 1.- EPC tempranas (3 días) 2.- EPC tempranas (5 semanas) 3.- EPC tardías 4.- HUVECs 5.- Control (-)

Tabla 1: Marcadores de células endoteliales y progenitoras EPC tempranas (3 día) eNOS+ / PAI-1+ / CD31+ CD133+/CD34+/OCT4+ EPC tempranas (2 semanas) eNOS+ / PAI-1+ / KDR-1+/LOX-1+ EPC tempranas (5 semanas) eNOS+ / PAI-1+ / KDR-1+/LOX-1+/TIE-2+/CD31+ EPC tardías KDR-1+/LOX-1+/TIE-2+/ CAV-1+/CD31+ HUVECs eNOS+ / PAI-1+ / KDR-1+/LOX-1+/TIE-2+/CD31+ CD133+/CD34+/OCT4+ EPC, endothelial progenitor cell; HUVECs, human umbilical vein endothelial cell

SINTESIS DE OXIDO NITRICO EN CELULAS PROGENITORAS DE ENDOTELIO EPC tempranas (2 semanas) EPC tempranas (5 semanas) EPC tardías (3 semanas) A B C Basal Ach Control DAF-2DA Control DAF-2DA Control DAF-2DA HUVECs

Células mononucleares EPC tempranas (3 días) EPC tempranas (10 días) EPC tempranas (4 semanas)

(Am J Cardiol 2006;98: 9P–17P)

AGRADECIMIENTOS Universidad de Concepción MsC. Liliana Lamperti Andrea Searle Dr. Daniel Durán Gabriela Toro Dr. Carlos Grant Verónica Cuevas Dr. Jorge Gajardo Enrique Guzmán MsC Margarita González Héctor Contreras Dr. Carlos Calvo Estefanía Nova Perla Salgado Carlos Salomón Financiamiento: Dirección de Investigación, Universidad de Concepción. DIUC 205.072.032-1.0, DIUC 205.072.031-1.0.