Movimiento de partículas cargadas por acción de un campo eléctrico ELECTROFORESIS Movimiento de partículas cargadas por acción de un campo eléctrico
MOVILIDAD ELECTROFORÉTICA Estado estacionario: q.E = f.v (f: coef. de fricción) q.E = 6r.v q.E = 6rme.E me = q / 6r v (cm/seg) = me.E me = v/E = d/t.E
FACTORES QUE AFECTAN LA ELECTROFORESIS
ELECTROFORESIS: FACTORES ELÉCTRICOS F = q.E fuerza electromotriz = trabajo E = I.R P = dW/dt P = E.dq/dt = E.I trabajo por unidad de tiempo = POTENCIA Desarrollo electroforético: Voltaje constante Corriente constante Potencia constante
ELECTROFORESIS Efecto del sobrecalentamiento EFECTOS: me R difusión C I corrientes convectivas desnaturalización pérdida de actividad enzimática o inmunológica otras P = dH/dt energía convertida en calor En un sistema de resistencia R: P = I2.R = I.V Causas de sobrecalentamiento: I V R o C
FACTORES QUE AFECTAN LA ELECTROFORESIS
Interacciones iónicas ELECTROFORESIS: Efecto de la fuerza iónica de la solución reguladora Estado estacionario: atmósfera iónica esférica Cuando se aplica E: deformación de la simetría esférica con desplazamiento del centro de carga de la atmósfera iónica. Efecto de arrastre, la atmósfera iónica se mueve en dirección opuesta a la del ion central. Reducción de la carga neta efectiva. me (1/)1/2
ELECTROFORESIS EFECTO DE LA FUERZA IÓNICA DE LA SOLUCIÓN REGULADORA Fuerza iónica baja: C I permite > V < tiempo < difusión capacidad buffer modificaciones de pH Fuerza iónica alta: disolución difusión capacidad buffer C I debe aplicarse < V > tiempo µ 0,02 - 0,1 M
ELECTROFORESIS Efecto del pH de la solución reguladora Modificación de la carga eléctrica de las proteínas Sentido de la electroforesis LIMITACIONES: Cambios en la solubilidad de los compuestos Desnaturalización de proteínas Alteración de las propiedades inmunológicas y/o enzimáticas
FACTORES QUE AFECTAN LA ELECTROFORESIS
MEDIOS SOPORTE: Materiales insolubles en sistemas acuosos, utilizados para disminuir las corrientes convectivas EFECTOS QUE INTRODUCEN EN LOS PROCESOS ELECTROFORETICOS Adsorción en el medio Inhomogeneidad de la matriz del material Electroendósmosis Difusión Efecto tamiz molecular CONSIDERACIONES PARA SU ELECCION Poder resolutivo Limitación de la magnitud del campo eléctrico Facilidad de manipulación, tinción y decoloración Posibilidad de valoración cuantitativa de los resultados Costo MEDIOS SOPORTE PARA ELECTROFORESIS Membranas de acetato de celulosa Geles: almidón, agar, agarosa, poliacrilamida Otros: Papel, Sephadex, polvo de celulosa, sílica gel, óxido de Al
Electroendósmosis Formación de doble capa eléctrica Asociación anión-contraión, ambos hidratados. E 0: Aniones inmóviles. Desplazamiento de cationes hidratados. Efecto: flujo neto de líquido que se desplaza hacia el cátodo
MEMBRANAS DE ACETATO DE CELULOSA ESTRUCTURA Inerte. Frágil y sensible a solventes FACTORES DIFERENCIALES Longitud de la cadena de celulosa Grado de acetilación (1- 40 %) Tamaño y distribución de los poros Volumen de los poros comparados con la matriz sólida (20-85%) Agentes hidratantes y grado de hidratación del acetato de celulosa Compuestos residuales del proceso de acetilación CONDICIONES DE TRABAJO Proceso de humectación previo para permitir que los poros sean lubricados por la solución buffer (equilibrio) UTILIDAD Buenas separaciones a bajo voltaje y en tiempos cortos Posibilidad de revelados diferenciales Puede ser transparentizado blanqueado o disuelto para el análisis por densitometría o eluido de las fracciones
FACTORES QUE AFECTAN LA ELECTROFORESIS
DESARROLLO ELECTROFORÉTICO
ELECTROFORESIS: TINCIONES
DENSITÓMETRO
Zona Prealbúmina Zona Albúmina Zona Alfa 1 Zona Alfa 2 Zona Beta 1 Zona Beta 2 Zona Gamma
DENSITOMETRÍA CORRESPONDIENTE A EUPROTEINEMIA
PROTEINAS COMPONENTES DE FRACCIONES ELECTROFORÉTICAS ZONA PREALBÚMINA PREALBÚMINA (TTR, transtiretina: 54.000; 4,7): transporta tiroxina y triyodotironina PROTEÍNA LIGANTE DE RETINOL (RBP: 21.000): en complejo con prealbúmina transporta vitamina A Indicadores de malnutrición y enfermedad hepática. ZONA ALBÚMINA ALBÚMINA (66.000; 4-5,8): Gran capacidad de transporte por la elevada concentración y la cantidad de cargas negativas: une bilirrubina, ácidos grasos, hormonas (tiroxina, triyodotironina, cortisol, aldosterona, drogas, calcio). Mantenimiento de la presión oncótica del plasma. Indicador de estado nutricional. MOVILIDAD ALFA 1 1-ANTITRIPSINA (AAT: 55.000; 4,8): Reactante de fase aguda con actividad antiproteasa (actúa contra quimotripsina, calicreína, renina, uroquinasa, plasmina, elastasa y colagenasa). Constituye casi el 90% de la banda proteica de la zona. 1-GLICOPROTEINA ACIDA (40.000; 2,7-4,0): Asociada con inflamación. 1-FETOPROTEINA (69.000): Mayoritaria en la circulación fetal. En el adulto, marcador de carcinoma hepatocelular. 1-LIPOPROTEINA (HDL, 200.000): Transportadora de lípidos (Apo A).
MOVILIDAD ALFA 2: MOVILIDAD BETA 1: MOVILIDAD BETA 2: MOVILIDAD GAMMA HAPTOGLOBINA (Hp: 80.000-400.000): Transportadora de oxihemoglobina en plasma. Proteína de fase aguda. 2-MACROGLOBULINA (AMG: 800.000; 5,4): En forma de AMG-complejos con proteasas (plasmina, pepsina, tripsina, quimotripsina) impide la proteolisis de compuestos de gran tamaño. CERULOPLASMINA (CER: 134.000; 4,4): Transportadora de cobre, cataliza procesos oxidativos. Proteína de fase aguda. VLDL-LIPOPROTEÍNA: relación con TG endógenos (zona pre-beta). MOVILIDAD BETA 1: TRANSFERRINA (SIDEROFILINA: 77.000; 5,7): Transportadora de hierro (es capaz de unir otros iones metálicos). HEMOPEXINA (57.000): Une hemo. -LIPOPROTEINA (LDL, 3.000.000): Transportadora de lípidos. C4 (206.000): Factor del sistema de complemento. Proteína de fase aguda. MOVILIDAD BETA 2: FIBRINOGENO 340.000; 5,5): Proteína de fase aguda. Precursor del coágulo de fibrina. 2-MICROGLOBULINA (11.800): Cadena liviana de los antígenos de histocompatibilidad de leucocitos. Marcador de insuficiencia funcional renal. C3 (180.000): Factor de complemento. Proteína de fase aguda. MOVILIDAD GAMMA
PROTEINOGRAMAS Normal - Inmunoglobulinas monoclonales Hiperinmunoglobulinemia policlonal - Fase aguda