INGENIERÍA GENÉTICA DE RUTAS CATABÓLICAS (Evolución experimental de rutas) ¿Porqué es necesario? ¿Cómo se hace? Aplicaciones (ejemplos) Bioseguridad

Dos grupo de compuestos Biogénicos (Se degradan) Dos grupo de compuestos Biotransformantes Xenobióticos Recalcitrantes (No se degradan)

Mineralización Biotransformación Recalcitrancia A) B) C) COOH COOH CL COOH CL Substrato Crecimiento Producto 1 2 1 2 1 2 Tiempo (Unidades)

¿Porqué? Muchos compuestos tóxicos YA son degradados por cepas naturales. Sin embargo, y para algunos compuestos concretos (organoclorados, organofosforados), la velocidad de degradación por organismos naturales es muy baja. Para moléculas muy complejas (y de aparición reciente en la naturaleza), NO es de esperar que UNA SOLA cepa tenga TODA la ruta necesaria para degradarla. En estos casos, se plantea CONSTRUIR CEPAS MEJORADAS para expandir las características naturales

CONSTRUCCIÓN DE RUTAS HÍBRIDAS AMPLIAR RUTA PREEXISTENTE Identificar pasos NO permisivos o cuello de botella Reclutar enzimas isofuncionales Mutagenizar y seleccionar enzimas con más amplio espectro de sustrato Añadir pasos a ruta preexistente Eliminar actividades NO deseadas "Adecuación" del regulador CONSTRUIR RUTA NUEVA Diseñar secuencia de pasos enzimáticos necesarios Reclutar las enzimas de distinta fuente

¿Cómo? Ingeniería de rutas Objetivo final: MEJORAR LAS CEPAS BACTERIANAS • Ganancia de función • Modificación de función • Pérdida de función Pasos limitantes más frecuentes: Especificad de las enzimas Fallo en la activación por el regulador Metodología: -MUTAGÉNESIS (para ganancia o pérdida de función) - al azar (requiere selección posterior) - dirigida -TRANSFERENCIA DE GENES - CONJUGACIÓN y recombinación - TRANSFORMACIÓN - y recombinación (ADN libre se integra en el cromosoma) - plásmidos (unidades replicativas independientes) -SELECCIÓN EN QUIMIOSTATOS

SELECCIÓN (Rif + catecol) La bacteria receptora A, resistente a rifampicina, no puede crecer con catecol Rif- B La bacteria donadora B, sensible a rifampicina, lleva plásmido con genes que metabolizan el catecol Rif+ Rif- A B CONJUGACIÓN Rif- Rif+ A B SELECCIÓN (Rif + catecol) DONADORA RECEPTORA TRANSCONJUGANTE

+ + TRANSFORMACIÓN Plásmido manipulado Bacteria Electrochoque o CaCl2 genA (o varios genes) oriV Ap + TRANSFORMACIÓN Bacteria Plásmido manipulado Electrochoque o CaCl2 + Selección A Proteína A Bacteria con función adicional

EVOLUCIÓN DE RUTAS CATABÓLICAS HORIZONTAL VERTICAL

EJEMPLO 1 ELIMINACIÓN BIOLÓGICA DE ALTAS CONCENTRACIONES DE NITRATO EN EFLUENTES DE FABRICACIÓN DE EXPLOSIVOS Producción de DNEG  Aguas residuales con alta carga de nitrato • Aislamiento de organismos tolerantes a altas concentraciones de nitrato. • Caracterización. • Establecimiento de las condiciones óptimas para la eliminación de nitrato. • Optimización del proceso (económica): Dilución de las aguas. Suministro de nutrientes. Fuente de carbono exógena. • Mejora genética de la cepa.

AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS 10 g de suelo en medio mínimo GLICEROL/NITRATO SIEMBRA (24, 48, 72 H) CULTIVO PURO 40 TIPOS DIFERENTES PURIFICACIÓN a

SELECCIÓN En glicerol “Clon 15” En etilenglicol “Clon AH1” NO3¯ NO2¯ Se analizan los 40 clones: Tiempo de generación (velocidad de crecimiento) Tolerancia a nitrato Eficiencia de eliminación de nitrato Klebsiella oxytoca En glicerol “Clon 15” En etilenglicol “Clon AH1” Arthrobacter globiformis NO3¯ NO2¯ NH4+ N orgánico Nitrato Reductasa Nitrito Reductasa nasA nasB 2e¯ 6e¯ Baja acumulación de nitrito a a

NO3¯ NO2¯ NH4+ nasA nasB Nitrato Reductasa Nitrito Reductasa 2e¯ 6e¯ tiempo (h) 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 30 nitrito (mM) 10 2 4 6 8 12 14 16 18 20 30 tiempo (h) amonio (mM)

NO3¯ NO2¯ NH4+ nasA nasB Gen nasB de K. pneumoniae oriT Plac Nitrato Reductasa Nitrito Reductasa nasA nasB 2e¯ 6e¯ KpnI Plac oriT pUPE2 9.552 kb R Gen nasB de K. pneumoniae tiempo (h) 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 30 nitrito (mM) 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 30 tiempo (h) amonio (mM)

EJEMPLO 2 DEGRADACIÓN BIOLÓGICA DE TNT (para aplicar en fábrica de explosivos) Explosivo militar y civil Almacenado desde la segunda guerra mundial (Alemania, USA). En desuso. Pérdidas en los embalajes de almacenamiento, desertización- Enriquecimiento y aislamiento de cepas (C1S1, Clon A) Selección de C1S1. TNT sólo es fuente de nitrógeno. Selección de ClonA (crecimiento rápido en TNT). Caracterización Fuentes de carbono óptima. Temperatura. Requerimiento de oxígeno. Crecimiento con TNT. Actividades enzimáticas. Crecimiento en aguas de la factoría. Metabolismo. Cultivo contínuo No utiliza el TNT como fuente de carbono. Construcción de cepas híbridas

Transferir plásmido TOL al Clon A H 3 NO2 TNT CO2 + H2O NO2¯ CH3 tolueno Plásmido TOL de P. putida CH3 tolueno COOH benzoato OH catecol CO2 + H2O Transferir plásmido TOL al Clon A C H 3 NO2 TNT NO2¯ CH3 tolueno COOH benzoato OH catecol CO2 + H2O

TNT como fuente de C y N Crecimiento Tiempo (días) ClonA 3 6 9 3 6 9 ClonA + TOL

EJEMPLO 3 Nitro-tolueno MINERALIZACIÓN DE MONONITROTOLUENOS CH3 Nitro-tolueno NO2 EJEMPLO 3 MINERALIZACIÓN DE MONONITROTOLUENOS Objetivo: Conseguir una cepa capaz de degradar p-nitrotolueno Las Enzimas de la ruta upper de degradación de tolueno de P. putida TOL puede llevar el p -nitrotolueno hasta nitrobenzoato. El activador XylR NO reconoce a p-nitrotolueno como activador. Ruta meta NO puede llevar el nitrobenzoato hasta CO2 + H2O. Necesitamos: Alterar el regulador XylR para que SÍ reconozca p-nitrotolueno y sea capaz de poner en marcha la ruta. Encontrar el segundo segmento de la ruta: nitrobenzoato hasta CO2 + H2O.

Regulación metabólica en TOL ELEMENTO DE CONTROL: Regulación metabólica en TOL pWW0 (ruta meta) P. putida mt -2 3-metilbenzoato l ¡ Reguladores + Pu xylUWCMABN Pm xylXYLTEGFJQKIH xylS Ps2 Ps1 Pr1 Pr2 xylR + + + - upper meta n n o tolueno 4NT

A B C D Mutagénesis química Regulador - 3-MBA 4NT XylR 180 1050 1900 CH2OH CH3 CH3 NO2 Mutagénesis química Regulador - 3-MBA 4NT XylR 180 1050 1900 2600 900 110 2110 3380 400 XylR6 1150 XylR49 1500 XylR7 150 A B C D 85 Pro  Ser 135 Asp Asn 172 Glu Lys

X P. putida 2440 (pWW0Pm) P. fluorescens 410PRif (pWW0Pm) + xylR6 H 3 N O 2 CH2OH NO2 CHO COOH P. fluorescens 410PRif (pWW0Pm) + xylR6 COOH NO2 CH2OH CH3 CHO NHOH NH3 OH CO2+H2O Rotura del anillo X P. fluorescens 410P COOH NHOH NH3 OH CO2+H2O NO2 Rotura del anillo

EJEMPLO 4 EXPANSIÓN DE LA CAPACIDAD DE DEGRADAR ALQUILAROMÁTICOS EL CASO DEL ETILBENZOATO COOH CH2CH3 Ruta TOL de P. putida puede degradar muchos derivados alquilados del benzoato, pero no etilbenzoato. Las limitaciones son: El etilbenzoato NO es efector del regulador XylS no se activa la ruta. La catecol 2,3-dioxigenasa se INACTIVA con etilcatecol. Estrategia Mutagenizar el regulador XylS para que pueda reconocer etilbenzoato Mutagenizar la cateco 2,3 dioxigenasa para que pueda “romper” etilcatecol

CO2 + H2O xylS* xylE* CO2 + H2O 3-metilbenzoato Efector + Sustrato COOH CH3 3-metilbenzoato Efector + Sustrato OH CO2 + H2O COOH CH2CH3 No es efector No es sustrato xylS* CH2CH3 OH COOH xylE xylE* COOH CH2CH3 OH CO2 + H2O

E E H H Pm Ap Tet pJLR100 pBR322 Ap Ligación EcoRI-HindIII E H Ap Pm Tet pJLR200

E.coli (pNM 185) (pJLR 200) xylS pNM 185 Ap Pm Tc pJLR 200 Ap,Km,Tc,4EB,EMS . . . . . . . . Km Ap,Km Ap,Km,Tc Ap,Km,Tc,4EB Tc-r en 3MB Tc-s en 4EB Ap Pm Tc pJLR 200 xylS4 Km pRD4

P.putida (pWW0) (pRD4) D 4EB,EMS L E pWW0 . . . . pERD4 Km . . . xylS4 4EB 3MB 4MB 3MB+ 4MB+ 4EB- D L E* pWW0 pERD4 Km xyylS4 P.putida (pWW0-EB)(pRD4)

EJEMPLO 5 COMPETENCIA ENTRE CEPA MANIPULADA Y CONSORCIO Degradación de naftalenosulfonato Se pretende comparar la eficiencia de un consorcio con la de una cepa manipulada genéticamente. Uno de los miembros del consorcio degrada naftaleno sulfonato hasta salicilato. El otro miembro del consorcio lleva salicilato hasta el ciclo de Krebs. La cepa manipulada puede mineralizar naftalenosulfonato La velocidad degradadora de ambos sistemas es equivalente. ¿Cómo compiten?

Consorcio Cepa manipulada P. putida NCIB9816 Sphingomonas BN6 SO3H OH COOH Sphingomonas BN6 P. putida NCIB9816 Sphingomonas BN6 COOH OH OH pWW60-3026 OH OH CHO COOH Cepa manipulada CO2 + H2O

COMPETENCIA EN QUIMIOSTATO 1010 109 Cepa manipulada Nº de células 108 P. putida 107 BN6 106 5 10 15 Tiempo (días)

CONSTRUCCIÓN DE CEPA CAPAZ DE DEGRADAR CLORO-Y METIL BENZOATOS Reclutamiento de la benzoate 1,2-dioxygenase Reclutamiento adicional de la -lactona isomerase B13 B13 B13 3CB 4CB 4MB 3CC OAA TCA 3CB 4CB 4MB 3CC 4CC 4MC OAA OAA º TCA TCA  -L 3CB 4CB 4MB 3CC 4CC 4MC OAA OAA  -L TCA TCA TCA  -L

EXISTEN PROBLEMAS LEGALES PARA LA LIBERACIÓN AL MEDIO DE ORGANISMOS MANIPULADOS GENÉTICAMENTE NECESITAMOS SISTEMAS DE CONTROL

SISTEMAS DE CONTROL DE MICROORGANISMOS MANIPULADOS GENÉTICAMENTE OBJETIVO: queremos que la cepa manipuLada desaparezca una vez que ha cumplido su función: contención biológica. Construcción de cepas de Pseudomonas putida portadoras de un sistema activo de contención biológica Caracterización del proceso de lisis en P. putida tras la inducción de la muerte celular Validación en microcosmos de las cepas construídas ESTRATEGIA: diseñar un sistema de muerte programada Buscar elemento matador Elegir elemento regular Ensamblar los componentes e introducirlos en la cepa de interés.

SISTEMA ACTIVO DE CONTENCIÓN BIOLÓGICA ELEMENTO REGULADOR ELEMENTO MATADOR P Gen regulador P Gen letal + La proteína reguladora impide la expresión del gen letal Señal externa

GENES MATADORES Nucleasas Proteínas tipo porinas Gen gef de E. coli Colapso del potencial de membrana Liberación de ARNasa periplásmica Permeabilización a iones Mg2+ Gen E del fago X174 Formación de túnel transmembrana Liberación del contenido citoplásmico

Gen gef

Regulación metabólica en TOL ELEMENTO DE CONTROL: Regulación metabólica en TOL pWW0 (ruta meta) P. putida mt -2 3-metilbenzoato l ¡ Reguladores + Pu xylUWCMABN Pm xylXYLTEGFJQKIH xylS Ps2 Ps1 Pr1 Pr2 xylR + + + - upper meta n n o tolueno

- + a a a a SISTEMA REGULADO DE CONTENCIÓN BIOLÓGICA Supervivencia P lac xyl S S 3MB I - + ELEMENTO REGULADOR Pm lac I Gen matador ELEMENTO MATADOR SI Supervivencia xyl S lac I P lac Pm S NO

ENSAMBLAJE DE LOS ELEMENTOS

Cepas contenidas biológicamente Cepa de P. putida Elemento matador Elemento control Pm xylS 2 lacI EEZ30 P gef R A 1 - 4 / 3 T c Km R pCC102 o r i 1 4 . 7 k b n i c CMC12 P gen E T el R A 1 - 4 / 3 m o b a a a a a a

Cepa control P. putida CMC12 ) glucosa 3MB (DO 3MB celular Crecimiento 660 nm glucosa 3MB 1 3MB 0.1 glucosa 0.01 4 8 12 16 20 4 8 12 16 20 24

P. putida CMC4 (pWW0) P. putida CMC12

P. putida CMC12

OTRAS TÉCNICAS DISPONIBLES Ingeniería de proteína DNA shuffling Sistemas asociados a la raíz (rizorremedio) Sistemas asociados a biofilms EN TODOS LOS CASOS, HAY QUE CONOCER EL FUNCIONAMIENTO DE LOS SISTEMAS