Estrategias de Secuenciación de Genomas José Guillermo Dávila Ramos Centro de Ciencias Genómicas, UNAM

Principios y Métodos más empleados Secuenciación del DNA Principios y Métodos más empleados

Genomas Secuenciados En años recientes, se ha logrado la secuenciación a gran escala del genoma de organismos eucariotes Los 5 primeros genomas secuenciados de organismos pluricelulares son: 1998 Caenorhabditis elegans - 8 x 107 pb - un nemátodo 2000 Homo sapiens - 3 x 109 pb - el Humano 2000 Arabidopsis thaliana - 1.15 x 108 pb- una planta 2000 Drosophila melanogaster - 1.65 x 108 pb - la mosca de la fruta 2002 Anopheles gambiae - 2.78 x 108 pb - el mosquito vector de la malaria

Secuenciación Tipo Sanger El método de secuenciación de Sanger aprovecha la forma normal de la replicación del DNA Para extender la cadena de DNA, usando la DNA polimerasa, deberá estar presente un grupo hidroxilo en el carbono 3’ de la deoxiribosa Los fragmentos se generan al agregar pequeñas cantidades de 2’ 3’ dideoxinucleótidos a la reacción lo que interrumpe la polimerización cada vez que son incorporados en la cadena de DNA La polimerasa usada deberá de carecer de la actividad de la exonucleasa de corrección 3’ > 5’ para que funcione el método

Dideoxinucleótidos La secuenciación de DNA usando el método de Sanger emplea 2’3’-dideoxinucleótidos trifosfatados ademas de los normales 2’-deoxinucleótido trifosfatado Ya que los 2’3’-dideoxinucleótidos trifosfato carecen del grupo 3’ hidroxilo, y la polimerización del DNA ocurre solo en la dirección 3’, cada vez que un 2’3’-dideoxinucleótido trifosfato es incorporado la extención se detiene 2’-deoxinucleótido monofosfato H P O OH HO CH2 NH2 N Azucar Base Fosfato 3’ 5’ 2’ 1’ 4’ H 2’3’-dideoxinucleótido monofosfato

Los 2’3’ dideoxi-nucleótidos terminan la síntesis del DNA H OH P O CH2 CH3 HN N ESQUELETO AZUCAR-FOSFATO H P O HO CH2 OH NH2 N NH B A S E S O H P HO CH2 H2N N HN H P HO O CH2 N H2N H2O 2’3’dideoxinucleótido Los 2’3’ dideoxi-nucleótidos terminan la síntesis del DNA

Plásmido con un fragmento clonado de DNA Secuenciación de DNA fragmento Clonado Prímero Sitios de Prímeros Plásmido con un fragmento clonado de DNA

La Reacción con ddATP 5’TTATCGTA 5’TTATCGTACCATGACTAGATGCGATA Pol. 5’TTATCGTA Ya no puedes! Pol. 5’TTATCGTACCATGACTAGATGCGATA A que la! 3’AATAGCATGGTACTGATCTTACGCTAT5’ Pol. 5’TTATCGTACCATGA Otra vez! Pol. 5’TTATCGTACCATGACTAGA No De nuevo! 5’TTATCG 5’TTATCGTA 5’TTATCGTACCATGACTAGATGCGA 5’TTATCGTACCA 5’TTATCGTACCATGACTA 5’TTATCGTACCATGA 5’TTATCGTACCATGACTAGA 5’TTATCGTACCATGACTAGATGCGATA

Separación de los Fragmentos Todos los métodos actuales de secuenciación requieren que la separación de los fragmentos de DNA detecten diferencias en longitud de una base Esto se logra por una electroforesis ya sea en geles de poliacrilamida o en capilares con polímeros líquidos

Separación de Fragmentos (Sanger) Los productos de las 4 reacciones, cada una conteniendo una pequeña cantidad de uno de los cuatro dideoxinucleótidos, son cargadas en el gel y sometidas a electroforesis Como la polimerización es solo en dirección 5’ a 3’, los fragmentos más cortos estarán en 5’ y los más largos que se encontrarán en la dirección 3’ ddTTP ddCTP ddGTP ddATP Lectura 5’ a 3’ desde la basa al tope

Applied Biosystems Applied Biosystems (ABI) ha desarrollado colorantes fluorescentes más sensibles, mejorado el método de cargado de la muestra y la electroforesis Cuatro colorantes que fluoresen a una longitud de onda distinta, pero con el mismo impacto en la movilidad electroforética, pueden ser usados para marcar ya sea los prímeros o los nucleótidos que terminan la reacción Si se usan los dideoxinucleótidos fluorados, la reacción de secuenciación completa se realiza en un solo tubo En lugar de los geles de poliacrilamida, se emplea un solo capilar con un polímero líquido que se remplaza al final de cada corrida

Secuencia con Terminadores Fluorados Pol. 5’TTATCGTA Let me Through! Pol. Agggg…. 5’TTATCGTACCATAATTGCA Pol. 5’TTATCGTACCATAATT Not Again! Pol. Oh come on! 5’TTATCGTACCAC 3’AATAGCATAACGTTAACGTTACGCTAT5’ 5’TTATCG 5’TTATCGTA 5’TTATCGTATTGCAAT 5’TTATCGTATTGCAATTG 5’TTATCGTATTGCAA 5’TTATCGTATTGCAATTGC 5’TTATCGTATTGCA 5’TTATCGTAT 5’TTATCGTATTG 5’TTATCGTATT Como la base al final de cada fragmento esta marcada con un fluoróforo único, la reacción total se puede hacer en un solo tubo 5’TTATCGTATTGC 5’TTATCGTATTGCAATT 5’TTATCGTATTGCAATTGCA

- + Sistema Prisma 310 ABI Capilar Pol. líquido Computer ….. Laser Big Hairy Computer ….. Placa caliente ATTGC A Capilar Pol. líquido Detectores - Laser Prisma Reacción Secuencia Ventana +

El ABI Prisma 3700 ABI Prism 3700

El Estado del Arte El ABI Prisma 3730XL, representa la última generación de equipos de secuenciación capilar automática El 3730XL puede secuenciar hasta 1,500,000 de bases diarias Con esta capacidad el genoma de una bacteria de 5,000,000 de pares de bases, puede ser totalmente secuenciado en un mes El desarrollo más reciente es la piro-secuencia, que incrementa en un orden de magnitud el número de bases obtenidas por día

Estrategias para la Secuenciación de Genomas Secuenciación al Azar y Secuenciación Jerárquica al Azar

Método de Secuenciación al Azar Genoma Secuenciación y alineamiento de los insertos Fragmentación ATTCGCTGGCGGT TTGCTGCAAAATTG CGGTATTGCGCTTGCTGC Refinamiento clonación ATTCGCTGGCGGTATTGCGCTTCTGCAAAATTG Secuencia final Plásmido Genoteca del genoma

Secuenciación Jerárquica al Azar BAC Genoma 2. Clonación 1. Fragmentación Genoteca de BACs 4. Secuenciación y alineamiento de los insertos de cada BAC 3. Secuencia de los bordes de los insertos de los BACs y alineamiento para crear un mapa de CONTIGS ATTCGCTGGCGGT TTGCTGCAAAATTG CGGTATTGCGCTTGCTGC Refinamiento ATTCGCTGGCGGTATTGCGCTTCTGCAAAATTG Secuencia final

Rhizobium NH4+ H2O CO2 N2 nódulo O2 Rizósfera suelo

El Genoma de Rhizobium etli Cromosoma circular Plásmidos f e d c a b = plásmido simbiótico

El primer genoma completo hecho en México