Condiciones que favorecen la desnaturalización Alta temperatura Baja fuerza iónica (repulsión de fosfatos) Alto pH (desprotonación de bases) Monitoreo de la desnaturalización Los enlaces conjugados de las bases generan absorción en el UV a 260nm Nucleótidos libres> ssADN> dsADN La temperatura a la cual la A260 alcanza la mitad de su valor máximo es denominada Tm La Tm depende de la concentración salina, pH, composición, longitud La condición standard es 0.12 M buffer fosfato de sodio (0.18 M en ion sodio
DESNATURALIZACION POR CALOR Oligonucleótidos cortos Tm = (A+T)x2oC + (C+G)x4oC Oligonucleótidos largos Tm = 81.5 +16.6Log [Na+]+ +0.41 (%CG) – 625/N N –length of oligo
Hidrólisis de ácidos nucleicos Ruptura de enlaces en el esqueleto polinucleotídico Hidrólisis ácida (1 mM HCl): ruptura del enlace glicosídico entre purinas y desoxiribosa (producto: ac. apurínico Hidrólisis alcalina (RNA)– clivaje del enlace fosfodiester
Renaturalización La desnaturalización es un proceso reversible Reanealing – reasociación de las cadenas de ADN
La reasociación de ADN no repetido se produce en un rango de 2-log Cinética de renaturalización La reasociación de ADN no repetido se produce en un rango de 2-log
Definición de Cot1/2: función inversa de la constante de velocidad (k) C0t ½ : valor de Cot cuando se reasoció un 50%
¿Complejidad del Genoma ? ¿Qué es? AAAAAAAAAAAAAAAA C= 1; L=16 ATATATATATATATATA C= 2; L=16 ATCATCATCATCATCA C= 3; L=16 C= 16; L=16 ATCGCTAGAACGTCTG
Curvas de reasociación de ADN no repetitivo (fragmentos de 500 nt) C = N ≈ 10,000 genes 200 genes ≈ 4,000 genes C0t1/2 3 genes 106 repeats If no repeated sequences: C = to genome size (nt-bp) N (genome size) is determined directly from C0t1/2
Reasociación para Eucariotes ≈ 20-25% altamente repetitivo: 2x106 copias ≈ 25-30% Moderadamente Repetitivo 350 copias ≈ 45-55% Copia única > 2 logs: diferentes poblaciones
¿Qué representan las secuencias únicas, moderadamente repetidas y altamente repetidas??? Leer del Lodish!!!!
Debemos empaquetarlo en un núcleo con un diámetro de 5 mm Empaquetamiento del ADN Eucariota En el genoma humano tenemos 3 x 109 bp distribuidos en 23 cromosomas La forma B-DNA ocupa 3.4 A/bp La longitud total del ADN celular humano es de 2 metros!!! Debemos empaquetarlo en un núcleo con un diámetro de 5 mm (10.000 veces) El DNA durante la interfase se encuentra condensdo formando un complejo nucleoproteico denominado cromatina
Chromatin Proteins
El ADN se enrolla alrededor del núcleo histónico: Nucleosomas 2 H2A 2 H2B 2 H3 2 H4 “Beads on a String” Nucleosomes -Contain a histone core octomer + 146 bp core DNA -Spaced ~200 bp apart (146 bp core DNA + 20-60 bp linker DNA) -Core DNA is protected DNases
La Histona H1 une 2 hélices de ADN 30-nm Fiber
2 Modelos para la fibra de cromatina de 30-nm
Un modelo de la estructura del cromosoma DNA exists in chromatin form during interphase DNA in most compact form (chromosomes) during metaphase of mitosis
¿Qué es el superenrollamiento?
Qué es el superenrollamiento? El superenrollamiento se produce en casi todos los cromosomas (circular o lineal) Relajado vs Superenrollado El ADN relajado no está superenrollado En el superenrrolamiento negativo el ADN está subenrollado (favorece el desapareamiento de la doble hélice (el ADN circular aislado de células siempre se encuentra superenrollado negativamente
L = T + W Linking Number (L or Lk) = número de veces que dos cadenas están entrelazadas Twists (T or Tw) = número de vueltas de hélice Writhes (W or Wr) = número de veces que el dúplex se entrecruza consigo mismo
L = T + W relaxed relaxed T = +3 T = +2 T = +1T = +0 W = +0 W = +1 W = +2 W = +3 L = T + W T = –3 T = –2 T = –1T = –0 W = +0 W = –1 W = –2 W = –3 relaxed
Qué hacen las topoisomerasas? 1. Cambian el linking number de la molécula de ADN mediante: A) Cortando una o ambas cadenas y luego, B) Enrollarlas mas o menos y uniendo nuevamente los extremos. 2. Usualmente relajan el ADN superenrollado
Type I Topoisomerases Topo I from E. coli 1) acts to relax only negative supercoils 2) increases linking number by +1 increments Topo I from eukaryotes 1) acts to relax positive or negative supercoils 2) changes linking number by –1 or +1 increments
Relaxation of SV40 DNA by Topo I Maximum supercoiled 3 min. Topo I 25 min. Topo I
Type II Topoisomerases All Type II Topoisomerases Can Catenate and Decatenate cccDNA molecules Circular DNA molecules that use type II topoisomerases: E. coli Eukaryotes -plasmids -mitochondrial DNA -E. coli chromosome -circular dsDNA viruses (SV40)
An E. coli Type II Topoisomerase: DNA Gyrase Topo II (DNA Gyrase) from E. coli 1) Acts on both neg. and pos. supercoiled DNA 2) Increases the # of neg. supercoils by increments of 2 3) Requires ATP
Sample Linking Number Questions 1) You have a relaxed 5,500 bp plasmid DNA molecule, which you treat with DNA gyrase to add 50 negative supercoils A. 5500 bp X 10 bp/turn = 550 turns B. L = T + W = 550 – 50 = 500
LOS CROMOSOMAS DE VIRUS: CLASIFICACIÓN Considerando el tipo de organismo que parasitan Los virus pueden clasificarse en: Bacteriofagos o fagos: virus que parasitan a bacterias Virus Animales. Virus vegetales Desde el punto de vista genético Virus cuyo material hereditario es ADN. Virus cuyo material hereditario es ARN. Virus cuyo material hereditario es ARN-ADN. Virus cuyo material hereditario es ADN-ARN.
Tipo de virus según huésped. Iridovirus (peste porcina) VIRUS CUYO MATERIAL HEREDITARIO ES ADN VIRUS ADN Tipo de Molécula Tipo de Hélice Tipo de virus según huésped. Familia de virus Circular Sencilla Fago ØX174 M13 Animal Parvovirus Doble Papovavirus (SV40, polioma) Adenovirus Herpetovirus (Herpes) Poxvirus (viruela) Iridovirus (peste porcina) Lineal Extremos cohesivos: Fago lØ80, 434, P2, 186) Redundancia terminal: serie T-par, T3 y T7
De los virus anteriormente indicados, algunos han sido ampliamente estudiados genéticamente por distintos motivos. Por tanto, no está demás añadir algunos detalles sobre varios de estos virus. El virus ØX174 ha sido empleado ampliamente en estudios sobre la replicación del ADN. Este virus ADN tienen una cápside poliédrica que contiene en su interior una molécula de ADN circular de hélice sencilla (hebra +) con 5.400 nucleotidos. Cuando el virus infecta a E. coli pasa por una forma replicativa duplex, formándose una molécula circular doble hélice (una hebra+ y una hebra -). A partir de la hebra - de esta doble hélice se sintetiza el ARN mensajero del virus que se traducirá para producir las proteínas de la cápside. También a partir de la hebra - se sintetizan nuevas hélices de tipo + que se encapsularán dentro de las cápsides para originar nuevas partículas virales. De los virus anteriormente indicados, algunos han sido ampliamente estudiados genéticamente por distintos motivos. Por tanto, no está demás añadir algunos detalles sobre varios de estos virus. El virus ØX174 ha sido empleado ampliamente en estudios sobre la replicación del ADN. Este virus ADN tienen una cápside poliédrica que contiene en su interior una molécula de ADN circular de hélice sencilla (hebra +) con 5.400 nucleotidos. Cuando el virus infecta a E. coli pasa por una forma replicativa duplex, formándose una molécula circular doble hélice (una hebra+ y una hebra -). A partir de la hebra - de esta doble hélice se sintetiza el ARN mensajero del virus que se traducirá para producir las proteínas de la cápside. También a partir de la hebra - se sintetizan nuevas hélices de tipo + que se encapsularán dentro de las cápsides para originar nuevas partículas virales. De los virus anteriormente indicados, algunos han sido ampliamente estudiados genéticamente por distintos motivos. Por tanto, no está demás añadir algunos detalles sobre varios de estos virus. El virus ØX174 ha sido empleado ampliamente en estudios sobre la replicación del ADN. Este virus ADN tienen una cápside poliédrica que contiene en su interior una molécula de ADN circular de hélice sencilla (hebra +) con 5.400 nucleotidos. Cuando el virus infecta a E. coli pasa por una forma replicativa duplex, formándose una molécula circular doble hélice (una hebra+ y una hebra -). A partir de la hebra - de esta doble hélice se sintetiza el ARN mensajero del virus que se traducirá para producir las proteínas de la cápside. También a partir de la hebra - se sintetizan nuevas hélices de tipo + que se encapsularán dentro de las cápsides para originar nuevas partículas virales. Partículas de ØX174 ADN de ØX174 Partículas de ØX174 ADN de ØX174 Partículas de ØX174 ADN de ØX174 Forma Replicativa de ØX174 Forma Replicativa de ØX174 Forma Replicativa de ØX174 El bacteriofago M13 tiene una cápside de tipo filamentoso dentro de la cual se encuentra una molécula circular de ADN de hélice sencilla de 6.400 nucleotidos. Al igual que ØX174, también pasa por una forma replicativa dúplex. El bacteriofago M13 tiene una cápside de tipo filamentoso dentro de la cual se encuentra una molécula circular de ADN de hélice sencilla de 6.400 nucleotidos. Al igual que ØX174, también pasa por una forma replicativa dúplex. El bacteriofago M13 tiene una cápside de tipo filamentoso dentro de la cual se encuentra una molécula circular de ADN de hélice sencilla de 6.400 nucleotidos. Al igual que ØX174, también pasa por una forma replicativa dúplex. Fago filamentoso M13 Esquema del bacteriofago M13 Fago filamentoso M13 Esquema del bacteriofago M13 Fago filamentoso M13 Esquema del bacteriofago M13 ØX174 Ha sido empleado ampliamente en estudios sobre la replicación del ADN tienen una cápside poliédrica molécula de ADN circular de hélice sencilla (hebra +) con 5.400 nt forma replicativa duplex de la hebra - se sintetiza el ARN mensajero que se traducirá para producir las proteínas de la cápside El virus SV40 (Papovavirus) tiene una cápside icosaédrica que encierra en su interior un ADN circular doble hélice de 5.243 pares de nucleotidos. El ADN de SV40 se asocia con las proteínas histónicas de las células animales que infecta formando de 20 a 24 nucleosomas. El ADN del virus del polioma (Papovavirus) y ADN de los Adenovirus que también es circular de doble hélice, se asocia con las proteínas virales V y VII para formar una estructura similar a la de la cromatina de los organismos eucariontes. Los Adenovirus están siendo utilizados en experimentos de terapia génica. El virus SV40 (Papovavirus) tiene una cápside icosaédrica que encierra en su interior un ADN circular doble hélice de 5.243 pares de nucleotidos. El ADN de SV40 se asocia con las proteínas histónicas de las células animales que infecta formando de 20 a 24 nucleosomas. El ADN del virus del polioma (Papovavirus) y ADN de los Adenovirus que también es circular de doble hélice, se asocia con las proteínas virales V y VII para formar una estructura similar a la de la cromatina de los organismos eucariontes. Los Adenovirus están siendo utilizados en experimentos de terapia génica. El virus SV40 (Papovavirus) tiene una cápside icosaédrica que encierra en su interior un ADN circular doble hélice de 5.243 pares de nucleotidos. El ADN de SV40 se asocia con las proteínas histónicas de las células animales que infecta formando de 20 a 24 nucleosomas. El ADN del virus del polioma (Papovavirus) y ADN de los Adenovirus que también es circular de doble hélice, se asocia con las proteínas virales V y VII para formar una estructura similar a la de la cromatina de los organismos eucariontes. Los Adenovirus están siendo utilizados en experimentos de terapia génica. Partículas del virus SV40 ADN de SV40 Partículas del virus SV40 ADN de SV40 Partículas del virus SV40 ADN de SV40
Fago filamentoso M13 El bacteriofago M13 tiene una cápside de tipo filamentoso dentro de la cual se encuentra una molécula circular de ADN de hélice sencilla de 6.400 nucleotidos. Al igual que ØX174, también pasa por una forma replicativa dúplex.
Su ADN se asocia con las histonas de la célula huésped SV40 (Papovavirus) ADN circular doble hélice de 5.243 pares de nucleotidos. tiene una cápside icosaédrica Su ADN se asocia con las histonas de la célula huésped
fago l El fago l posee una cápside icosaédrica con una cola. Dentro de la cápside existe una molécula de ADN doble hélice lineal con 48.000 pares de bases.
fagos de la serie T cápside icosaédrica con cola que encierra en su interior ADN doble hélice lineal (aproximadamente 166.000 pb). Presentan redundancia terminal: repetición de una secuencia de 2.000 a 6.000 bp en los dos extremos
LOS CROMOSOMA DE LAS BACTERIAS: ORGANIZACIÓN EN DOMINIOS
La circularidad del cromosoma de E. coli se demostró mediante estudios genéticos de construcción de mapas de tiempo mediante la técnica de la conjugación interrumpida (Jacob y Wollman, 1958). F. Jacob E. L. Wollman la primera evidencia citológica se obtuvo más tarde (Cairns, 1963) marcando radiactivamente el ADN, realizando una autorradiografía y analizando los resultados al microscopio óptico.
PROTEÍNAS BACTERIANAS SEMEJANTES A LAS HISTONAS En bacterias se han encontrado proteínas con características muy semejantes a las histonas de los organismos eucariontes. la HU que es un dímero de subunidades diferentes y semejante a la histona H2B la proteína H dímero de subunidades idénticas y semejante a la histona H2A la proteína P semejante a las protaminas, la subunidad H1, el dímero HLP1 y el monómero HLP1.
PROTEÍNAS BÁSICAS DETECTADAS EN BACTERIAS Proteína Composición Contenido por células Semejanza con eucariontes HU Dímero subunidades y de 9.000 d. 40.000 dímeros Histona H2A H Dímero subunidades idénticas de 28.000 d. 30.000 dímero Histona H2B IHF Subunidad de 10.500 d. Subunidad de 9.500 d. Desconocido Desconocida H1 Subunidad de 15.000 d. 10.000 copias HLP1 Monómero de 15.000 d. 20.000 copias P Sububnidad de 3.000 d. Protaminas
LOS PLASMIDIOS elementos genéticos extracromosómicos Moléculas de ADN doble hélice circular que se replican de forma autónoma e independiente a la del cromosoma principal y que pueden, en algunas situaciones, integrarse en el cromosoma principal bacteriano y a partir de ese momento replicarse al mismo tiempo. El tamaño y número de los plasmidios es muy variable (2.000 a 100.000 pares de bases/1-100 copias por célula) . Los plasmidios se pueden se clasifican según las funciones o el tipo de información que llevan en: Factores de Fertilidad o factores F. Factores de resistencia de transferencia a drogas, factores RTF o factores R. Factores colicinógenos, factores Col o factores Cf. Las colicilinas son sustancias que matan a las bacterias. Naturalmente las bacterias productoras de colicilinas son inmunes a ellas.
Algunas preguntas-ejercicios….