TERAPIA GENICA Transferencia de material genético para tratar/corregir una enfermedad causada por la ausencia, o mal funcionamiento de un gen. EX-VIVO vs IN- VIVO CÉLULAS SOMATICAS vs CÉLULAS MADRE/ PRECURSORAS (STEM CELLS)

USO DE RETROVIRUS EN TERAPIA GENICA

Vector Viral Recombinante que contiene el gen terapeútico Infección in vitro de células Ex-vivo In vivo Selección de las células corregidas Consideraciones: Riesgo de efectos secundarios Eficiencia de la transferencia de genes Expresión contínua del gen terapeútico

CONSIDERACIONES EN LA TERAPIA GENICA - Conocer y entender la causa de la enfermedad - Conocer la estructura y función del gen a introducir - Eficiencia de la transferencia del gen en células blanco Control de la expresión del gen Prevención y control de la respuesta inmune Riesgo de efectos secundarios (ej: uso de vectores virales) - Ensayos en animales - Ensayos clínicos

ESTRATEGIAS DE TERAPIA GENICA Reemplazo del gen Incremento de la expresión del gen (Gene augmentation therapy, GAT), por ej.: fibrocis cistica. Corrección del gen Eliminación dirigida de celulas blanco específicas (ej. uso combinado de virus + prodrogas) Inhibición de la expresión de un gen (gen ablation)- ej: antisense, ribozimas, RNA de interferencia .

Inhibición de la expresión Ribozymes ( Ribozimas) pueden cortar el mRNA específico Antisense oligos (oligonucleótidos antisentido) inhiben la traducción del mRNA siRNA (small interference RNA) RNA pequeño de interferencia dirigido a un mRNA específico induciendo el corte del mRNA en fragmentos pequeños (de aprox. 23 pb)

Mecanismo de corte por ribozima 5’- - c g g a g u c a c u u c g - - 3’ mRNA 3’ G C C U C A U G A A G C 5’ A I G C U AG Ribozima

Genetic Pro-drug Activation Therapy Targeted Killing - Genetic Pro-drug Activation Therapy viral vector thymidine kinase gene tumour cell ganciclovir phosphate ganciclovir tk (Tóxico sólo si ha sido fosforilado)

Transferencia del Gen In vivo: el vector se trasfiere directamente al paciente (inyectable, respirado) Ex vivo: se modifica las celulas del paciente en el laboratorio antes de re-introducirlas (ej. hepatocitos, fibroblasto, celulas hematopoyeticas, etc.)

METODOS DE TRANSFERENCIA DEL DNA EXOGENO A CELULAS EUCARIOTES I. Metodos fisicos: - transfección - microinjección - bombardeo de partículas de DNA recubiertas con tungsteno, oro (“gene gun”) - electroporación II. Metodos no virales: liposomas, transferencia mediada por receptores. III. Metodos virales: virus de DNA, virus de RNA.

METODOS DE TRANSFERENCIA Metodos físicos No limitado por el numero de genes o tamaño de fragmento. Poco eficiente. - Inyección de DNA desnudo - Electroporación - Gene gun

Gene Gun (pistola de genes)

EFECTO DE LA ELECTROPORACION EN MEMBRANA

Metodos no virales - liposomas transferencia mediada por ligandos o receptores específicos Desventajas: Expresión transiente Baja eficiencia de transferencia de genes

III. Metodos Virales - Mayor eficiencia de transducción Mayor riesgo Retrovirus : ej.:- Moloney murine leukaemia virus (Mo-MuLV), HIV Adenovirus Herpes Simplex (HSV) Virus Adeno-asociados (AAV) Lentivirus

Retrovirus - Alta eficiencia -Requiere que la célula esté en división - Hasta 8 kb - Integración al genoma del hospedero - Alto riesgo

Adenovirus: Alta eficiencia de transducción Hasta 8 kb Infecta celulas diferenciadas y tambien en replicación Desventajas: - Expresión transiente (gen no integrado al genoma) - Las proteinas virales pueden ser expresadas - Problemas por la respuesta inmune Herpes Simplex: fragmentos largos - expresión por mayor tiempo - sistema nervioso central - poco eficiente

Adenovirus Se puede direccionar al virus hacia un tejido o tipo de célula en particular, acoplando ligandos para receptores específicos.

CELULA DE EMPAQUETAMIENTO (para la producción de particulas virales recombinantes)

CELULA DE EMPAQUETAMIENTO (liberación de particulas virales recombinantes, infectivas pero no replicativas)

CONSIDERACIONES EN LA TERAPIA GENICA - Conocer y entender la causa de la enfermedad - Conocer la estructura y función del gen a introducir - Eficiencia de la transferencia del gen en células blanco Control de la expresión del gen Prevención y control de la respuesta inmune Riesgo de efectos secundarios (ej: uso de vectores virales) - Ensayos en animales - Ensayos clínicos

CLONACION TERAPEUTICA

Defecto en la actividad de la Adenosina Deaminasa (ADA) Primer Protocolo de Terapia Génica (1990) Sindrome de Inmunodeficiencia Combinada Severa (SCID) Defecto en la actividad de la Adenosina Deaminasa (ADA)

Protocolos de Terapia Génica en Cancer.

RNA de interferencia en la terapia para Cancer

Gene Therapy Journals (Scientific, peer-reviewed publications targeted to clinicians and researchers.) Cancer Gene Therapy - From the publishers of Nature. Current Gene Therapy - From Bentham Science Publishers. Gene Therapy - From the publishers of Nature. Human Gene Therapy - Journal published by Mary Anne Liebert, Inc. The Journal of Gene Medicine - Official journal of the European Society of Gene Therapy (ESGT), Japan Society of Gene Therapy (JSGT), and the Australasian Gene Therapy Society (AGTS). Molecular Therapy - A monthly journal published by the American Society of Gene Therapy (ASGT). Other Publications