Vectores virales para usos de Terapia Génica

Presentación del tema: "Vectores virales para usos de Terapia Génica"— Transcripción de la presentación:

1 Vectores virales para usos de Terapia Génica
Manel Cascalló, Ph.D. Grup de Terapia Gènica Laboratorio de Investigación Translacional Hospital Duran i Reynals

2 Terapia génica: definición
Reintrodución de material genético capaz de curar o atenuar la progresión de una enfermedad.

3 Terapia génica: definición
DNA GEN normal RNA Proteína normal

4 Terapia génica: definición
Ausencia de proteína DNA Proteína anormal RNA alterado GEN alterado RNA Proteína normal

5 Terapia génica: definición
Ausencia de proteína DNA GENES:  Causantes de enfermedades  Posibles dianas terapéuticas Proteína anormal RNA alterado GEN alterado RNA Proteína normal

6 Terapia génica: definición
Reintrodución de material genético capaz de curar o atenuar la progresión de una enfermedad.  mayor especificidad de acción

7 Terapia génica: definición
Reintrodución de material genético capaz de curar o atenuar la progresión de una enfermedad.  mayor especificidad de acción  mayor potencial terapéutico, al inducir cambios fundamentales en los parámetros fenotípicos de la enfermedad

8 Terapia génica: avances tecnológicos
Aislamiento e identificación de genes terapéuticos Desarrollo de vectores de transferencia

9 Terapia génica: barreras extracelulares
BARRERAS DE TEJIDO * Membranas conectivas * Epitelio vascular * Membrana hemato-encefálica * Mielina PROTEÍNAS INACTIVADORAS * Proteínas séricas de carga positiva * Proteasas/nucleasas BARRERAS INMUNOLÓGICAS * Respuesta inmune cellular * Anticuerpos * Complemento

10 Direccionalidad de la transcripción
Terapia génica: barreras intracelulares Vector-transgen Interacción Liberación DNA/ Transporte al núcleo Proteína transferida Localización transgen Direccionalidad de la transcripción

11 Características del vector ideal
expresión prolongada del transgén inmunológicamente inerte expresión regulable selectividad hacia el tipo celular deseado capacidad del transgén a incorporar fácil producción y a títulos elevados integración baja transmisibilidad a células germinales

12 Vectores usados en terapia génica
DNA “desnudo” liposomas catiónicos condensados de DNA electroporación pistolas de DNA 1.- no virales sistemas “físicos”

13 Vectores usados en terapia génica
DNA “desnudo” liposomas catiónicos condensados de DNA electroporación pistolas de DNA 1.- no virales 2.- virales  clasificables en base a: capacidad integrativa capacidad replicativa

14 Vectores usados en terapia génica
DNA “desnudo” liposomas catiónicos condensados de DNA electroporación pistolas de DNA 1.- no virales Integrativos: retrovirus lentivirus virus adenoasociados 2.- virales  clasificables en base a: capacidad integrativa no integrativos capacidad replicativa adenovirus Herpes simplex virus

15 Vectores usados en terapia génica
DNA “desnudo” liposomas catiónicos condensados de DNA electroporación pistolas de DNA 1.- no virales 2.- virales  clasificables en base a: capacidad integrativa vectores replicativos capacidad replicativa vectores no replicativos

16 Terapia génica: vectores usados en protocolos clínicos
Número de protocolos 212 35,8 % 164 27,7 % 37 6,2 % 13 2,2 % 5 0,5 % 77 13,0 % 55 9,3 % 5 0,8 % 5 0,8 % Fuente: “The Journal of Gene Medicine” © John Wiley & Sons, 2001 22 3,7 %

17 Terapia génica: vectores usados en protocolos clínicos
Número de protocolos 212 35,8 % 164 27,7 % 72,4 % 37 6,2 % 13 2,2 % 5 0,5 % 77 13,0 % 55 9,3 % 5 0,8 % 5 0,8 % Fuente: “The Journal of Gene Medicine” © John Wiley & Sons, 2001 22 3,7 %

18 Del virus al vector vírico: ciclo viral
1.- INFECCIÓN 2.- REPLICACIÓN

19 Del virus al vector vírico: ciclo viral
1.- INFECCIÓN 2.- REPLICACIÓN

20 Del virus al vector vírico: ciclo viral
introducción del genoma viral 1.- INFECCIÓN 2.- REPLICACIÓN

21 Del virus al vector vírico: ciclo viral
introducción del genoma viral 1.- INFECCIÓN expresión de proteínas tempranas reguladoras 2.- REPLICACIÓN

22 Del virus al vector vírico: ciclo viral
introducción del genoma viral 1.- INFECCIÓN expresión de proteínas tempranas reguladoras 2.- REPLICACIÓN

23 Del virus al vector vírico: ciclo viral
introducción del genoma viral 1.- INFECCIÓN expresión de proteínas tempranas reguladoras 2.- REPLICACIÓN expresión de proteínas estructurales

24 Del virus al vector vírico: ciclo viral
introducción del genoma viral 1.- INFECCIÓN expresión de proteínas tempranas reguladoras 2.- REPLICACIÓN expresión de proteínas estructurales + replicación del DNA

25 Del virus al vector vírico: ciclo viral
introducción del genoma viral 1.- INFECCIÓN expresión de proteínas tempranas reguladoras 2.- REPLICACIÓN expresión de proteínas estructurales + replicación del DNA producción de nuevos virus

26 Del virus al vector vírico: construcción de vectores
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 mu y genoma viral gen temprano casete de expresión gen interés (transgén) promotor poly-A 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 mu y vector

27 secuencias adyacentes (en “cis”)
Del virus al vector vírico: construcción de vectores introducción del genoma viral: TRANSDUCCIÓN expresión de proteínas tempranas reguladoras casete de expresión replicación del DNA gen interés (transgén) promotor poly-A producción de nuevos virus 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 mu y vector secuencias adyacentes (en “cis”)

28 secuencias adyacentes (en “cis”)
Del virus al vector vírico: construcción de vectores introducción del genoma viral: TRANSDUCCIÓN expresión de proteínas tempranas reguladoras casete de expresión replicación del DNA gen interés (transgén) promotor poly-A producción de nuevos virus 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 mu y vector expresión del transgén secuencias adyacentes (en “cis”)

29 Del virus al vector vírico: construcción de vectores
célula normal célula “empaquetadora” (packaging) DNA del vector DNA del vector expresión del transgén expresión del transgén proteínas virales Genoma celular Genoma celular o plásmido genes virales (complementación en “trans”) producción de nuevos virus

30 Problemática de la construcción de vectores
probabilidad de recombinación entre genomas para generación de partículas competentes para replicación (RCV) complejidad del genoma viral: desbalance de la producción en “cis” y en “trans” retención de proteínas virales en los vectores que actúan como inmunógenas toxicidad de las proteínas virales en las células empaquetadoras difícil escalado de los procesos

31 transcriptasa reversa
Vectores retrovirales (Rv) glicoproteína de membrana LTR gag pro pol envuelta lipídica U3 R U5 U3 R U5 cápside genoma RNA att PBS y / y’ env PPT att proteasa integrasa transcriptasa reversa (progenoma: 7 a 11 Kb) casete de expresión gen interés (transgén) promotor poly-A LTR U3 R U5 U3 R U5 att PBS y / y’ PPT att

32 Vectores retrovirales (Rv): propiedades
Capacidad máxima del inserto: 8 kb Integración al azar en el genoma huésped (progenoma) Necesidad de división celular para una transducción efectiva (excepción: familia de los lentivirus) Poco inmunogénicos Mucha experiencia clínica Ejemplos: Familia oncotrópicos: M-MLV Familia lentivirus: HIV-1, SIV

33 Vectores adenovirales (Ad)
fibra pentón / hexón L4 L3 MLP/TL L2 L1 E1 E3 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 mu ITR y ITR E2B E2A E4 genoma DNA (ds) (genoma: 36 Kb) casete de expresión gen interés (transgén) promotor poly-A 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 mu ITR y ITR

34 Vectores adenovirales (Ad): propiedades
Capacidad máxima del inserto: 8 kb No integración: se mantiene de forma episómica Se pueden obtener con altos títulos (> vp/ml) Muy inmunogénicos Tropismo para células de origen epitelial, a las que infectan con alta eficiencia Altamente bio-seguros Ejemplos: Ad-2 Ad-5

35 origen de replicación de HSV
Vectores derivados de Herpes simplex (HSV) Elementos repetidos invertidos flanqueantes a b c Ul : “unique long” Us : “unique short” cápside proteína del tegumen envuelta lipídica glicoproteína genoma DNA (ss) (genoma: 152 Kb) vectores tipo “amplicones” vectores derivados del genoma entero locus de las proteínas “immediate early” gen interés (transgén) promotor poly-A origen de replicación de HSV a b b a a c c a y gen interés (transgén) promotor poly-A

36 Vectores derivados de Herpes simplex (HSV): propiedades
Capacidad máxima del inserto: hasta 30 kb Se mantienen en forma de ciclo lisogénico (infección latente) Dan lugar a una expresión del transgén prolongada Tropismo para células neuronales Poca experiencia clínica Ejemplos: HSV-1 HSV-2

37 Vectores derivados de virus adenoasociados (AAV)
TR (145 bp) TR Rep Cap (genoma: 5,1 Kb) casete de expresión TR (145 bp) TR promotor transgén poly-A

38 Vectores derivados de virus adenoasociados (AAV): propiedades
Capacidad máxima del inserto: 4,5 kb Integrativos al azar Dan lugar a una expresión del transgén prolongada (hasta 2 años) Forman concatenámeros, lo que permite augmentar el tamaño del inserto que pueden contener Poca respuesta inmunológica Bio-seguros Ejemplos: AAV-2 AAV-5

39 Comparación entre vectores virales
PROBLEMA ALTERNATIVA retrovirus Requerimiento de división Vectores lentivirales Mutagénesis insertacional Obtención de títulos bajos Uso de proteínas de envoltorio de otros virus lentivirus Bio-seguridad Vectores híbridos con no-humanos adenovirus Alta inmunogenicidad Vectores “gutless” Direccionamiento del vector (“targeting”) Herpes simplex Toxicidad de la proteínas en “trans” en cél. empaquetadoras Nuevas delecciones Adeno-asociados Poco tamaño del inserto Uso de los concatenámeros Producción difícil

40 Vectores virales: nuevas estrategias (1) Vectores híbridos
Vectores “mezcla” que intentan combinar propiedades de más de un vector Ejemplos: pseudo-tipado (substitución de una partícula de la cápside viral por otra de un virus distinto) Ej. vectores retrovirales con la prot G del VSV combinación de vectores adenovirales y AAV, para obtener la capacidad integrativa encapsulación de genomas retrovirales en un virus adenoviral

41 Vectores virales: nuevas estrategias (2)
Vectores replicativos condicionales (CRV) Vectores mutantes que actúan como virus salvajes en células con determinadas características genéticas, llevando a su muerte. Utilidad en la terapia génica del cáncer Célula normal: replicación abortiva Virus mata a la célula tumoral,y se expande a las células vecinas replicación productiva: lisis celular Virus oncolítico Célula tumoral Ejemplos: Adenovirus (CRA) : ONYX-015, AdD24 Herpes virus : G207